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转录因子RUNX1与KLF4相互作用及转录调控对t(8；21)白血病细胞生物学功能的影响；新型LSD1抑制剂JL1037的抗白血病作用及其机制研究

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第一部分 转录因子RUNX1与KLF4相互作用及转录调控对t(8；21)白血病细胞生物学功能的影响

摘要

前言

材料与方法

实验结果

讨论

参考文献

第二部分 新型LSD1抑制剂JL1037的抗白血病作用及其机制研究

摘要

前言

材料与方法

讨论

参考文献

综述：LSD1在正常造血和白血病中生物学功能及LSD1抑制剂的发展现状

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摘要

本文主要从以下几个部分展开论述：
　　第一部分 转录因子RUNX1与KLF4相互作用及转录调控对t(8;21)白血病细胞生物学功能的影响
　　研究目的:实验室前期用组蛋白去乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠(PB)诱导t(8;21)白血病细胞系Kasumi-1分化、凋亡时发现，RUNX1、KLF4和P57的表达水平明显升高，且通过生物信息学分析发现三者之间可能存在转录调控关系及蛋白质相互作用。本研究旨在分析RUNX1、KLF4和P57之间的相互作用关系，并通过体外、体内实验探讨RUNX1、KLF4和P57在t(8;21)白血病细胞中的生物学功能。
　　研究方法:实时定量PCR技术和Western Blot技术检测PB处理Kasumi-1细胞后RUNX1、KLF4和P57的mRNA和蛋白表达变化。构建包含RUNX1结合位点的KLF4启动子/增强子报告质粒和包含KLF4结合位点的P57启动子/增强子报告质粒，双荧光素酶报告基因系统分析RUNX1、RUNX1-ETO对KLF4的转录调控作用以及KLF4对P57的转录调控作用，并应用Western Blot技术在蛋白水平进行验证。免疫荧光共聚焦和免疫共沉淀技术检测转录因子RUNX1、RUNX1-ETO与KLF4的共定位以及蛋白质相互作用，明确具体的结合结构域，并进一步探讨PB能否抑制RUNX1、RUNX1-ETO与KLF4的结合。双荧光素酶报告基因系统分析RUNX1、RUNX1-ETO与KLF4结合对KLF4转录调控功能的影响。构建RUNX1、KLF4和P57的慢病毒表达载体，包装病毒，感染Kasumi-1细胞，研究上述基因过表达对t(8;21)白血病细胞增殖、周期、凋亡和分化等生物学功能的影响。构建KLF4和P57逆转录病毒表达载体，包装病毒，感染t(8;21)白血病小鼠的骨髓白血病细胞，流式细胞仪分选阳性细胞，移植受体小鼠，研究KLF4和P57过表达对t(8;21)白血病小鼠发病率和生存期的影响。
　　研究结果:PB处理Kasumi-1细胞后，RUNX1、KLF4和P57的mRNA和蛋白表达水平均明显升高。RUNX1以剂量依赖性的方式激活KLF4启动子/增强子报告质粒，而RUNX1-ETO对KLF4启动子/增强子报告质粒的转录激活作用明显减弱。KLF4对P57启动子/增强子报告质粒亦存在剂量依赖性的激活作用。在细胞系中过表达RUNX1可以上调KLF4和P57的蛋白表达;而过表达RUNX1-ETO对KLF4和P57的蛋白表达无明显影响;过表达KLF4，P57的蛋白表达升高。RUNX1、RUNX1-ETO与KLF4均存在蛋白质相互作用，且共定位于细胞核内。RUNX1通过RUNT同源结构域(Runt homology domain，RHD)与KLF4结合，RUNX1-ETO除了通过RHD还通过ETO部分与KLF4结合。RUNX1-ETO竞争性地抑制野生型RUNX1与KLF4的结合，组蛋白去乙酰化酶抑制剂PB不影响RUNX1、RUNX1-ETO与KLF4的结合。RUNX1与KLF4结合促进KLF4对下游靶基因的转录激活，而RUNX1-ETO与KLF4结合对下游靶基因转录并无明显的促进作用。在t(8;21)白血病细胞中过表达RUNX1、KLF4和P57均能抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡，此外，KLF4还具有诱导白血病细胞分化的生物学功能。体内实验结果表明，KLF4和P57过表达可以降低t(8;21)白血病小鼠的发病率。
　　研究结论:本研究发现了t(8;21)白血病细胞系中RUNX1→KLF4→P57新的调控信号通路，RUNX1通过转录激活KLF4进而激活P57抑制t(8;21)白血病细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡。而当RUNX1发生染色体易位形成RUNX1-ETO融合蛋白时，上述作用消失。此外，RUNX1还通过与KLF4发生蛋白质相互作用，进一步增强KLF4对下游靶基因的转录激活，上述作用可以被RUNX1-ETO竞争性地抑制。本研究阐明了转录因子RUNX1与KLF4之间的作用关系以及RUNX1-ETO融合蛋白对这种作用关系的影响。
　　第二部分 新型LSD1抑制剂JL1037的抗白血病作用及其机制研究
　　研究目的:组蛋白赖氨酸特异性去甲基化酶1(LSD1)在白血病中高水平表达且与预后不良相关，敲降LSD1的表达或药物抑制LSD1的活性可以显著降低白血病干细胞的集落形成能力，延长白血病小鼠的生存时间。因此，设计并合成高效低毒的LSD1抑制剂有望成为白血病治疗的新策略。JL1037是一个高效、高选择性、可逆性的新型LSD1抑制剂，本研究旨在探讨该化合物在体外和体内对于白血病细胞的杀伤作用以及相关分子机制。
　　研究方法:实时定量PCR技术和Western Blot技术检测LSD1在白血病细胞系和正常人骨髓单个核细胞中的表达水平，筛选高表达LSD1的细胞系用于后续细胞功能实验;Western blot检测JL1037对LSD1底物组蛋白H3K4、H3K9甲基化水平以及对组蛋白H3乙酰化水平的影响;MTS法检测JL1037对白血病细胞增殖能力的影响，用SPSS软件计算半数抑制剂量(IC50);流式细胞术检测JL1037对细胞周期分布、细胞凋亡的影响，瑞氏染色观察不同浓度的药物处理后细胞形态学的变化;Westernblot检测JL1037处理后细胞周期蛋白(P21、P27、P57)、细胞凋亡相关蛋白(Caspase3、PARP)和BCL-2家族蛋白(BCL-2、BCL-XL、BAX)表达变化。构建LSD1 shRNA慢病毒载体，包装病毒，感染THP-1和Kasumi-1细胞，敲降LSD1的表达，进一步验证JL1037是否通过特异性作用于LSD1这一靶点发挥生物学功能。免疫荧光染色和Western Blot检测JL1037对自噬相关蛋白LC-3Ⅱ表达和分布的影响，透射电镜观察JL1037处理后细胞内自噬小体、自噬溶酶体的形成情况;将JL1037和自噬抑制剂氯喹(CQ)单独及联合应用，检测细胞凋亡情况;Ficoll法分离正常供者和AML患者骨髓单个核细胞，免疫磁珠法分选脐带血CD34+造血干/祖细胞，流式细胞术检测JL1037对上述细胞凋亡的影响，将JL1037与氯喹(CQ)单独及联合应用，进一步检测细胞的凋亡情况。体内治疗实验使用共表达AML1-ETO和C-KITD816V的白血病小鼠模型，实验小鼠随机分为三组，分别通过尾静脉注射JL1037（2.5mg/kg.d、5mg/kg.d）和PBS进行治疗，动态监测小鼠体重及外周血白血病细胞比例的变化，记录并比较各组小鼠的生存期有无差异。药物毒性实验使用正常的C57 BL/6小鼠，尾静脉注射PBS和JL1037(5mg/kg.d)，连续10天，给药结束后处死小鼠，比较两组小鼠器官重量和器官组织学形态有无差异。
　　研究结果:LSD1 mRNA和蛋白在白血病细胞系中的表达水平显著高于正常人骨髓单个核细胞，以Kasumi-1、K562和THP-1细胞最为显著。JL1037处理THP-1和Kasumi-1细胞后，组蛋白H3K4的单、双甲基化水平升高，呈现剂量依赖性，组蛋白H3K9的甲基化水平和组蛋白H3的乙酰化水平无明显变化。JL1037对THP-1和Kasumi-1细胞的增殖有显著的抑制作用，48h的IC50分别为(30.3±2.22)μM和(19.42±3.02)μM。JL1037激活caspase依赖的细胞凋亡，且呈现剂量依赖性，同时激活线粒体凋亡信号通路，表现为促凋亡蛋白Bax表达上调以及抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL表达下调。低剂量的JL1037阻滞细胞周期于S期，随着药物浓度的增加，细胞周期被阻滞于G0/G1期，相关机制研究表明JL1037上调细胞周期相关蛋白P21和P57表达。LSD1敲降实验证实，JL1037通过作用于LSD1这一靶点发挥生物学作用。细胞自噬实验结果显示，JL1037处理后细胞内自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达水平显著上调，细胞内出现自噬小体和自噬溶酶体，自噬抑制剂氯喹(CQ)与JL1037联合使用将进一步促进白血病细胞凋亡。同时，JL1037显著促进急性髓系白血病患者的原代细胞凋亡而对正常的造血细胞作用相对较弱。在体内实验中，JL1037抑制t(8;21)白血病的进展，显著延长白血病小鼠的生存期，同时显示出了一定程度的毒性作用。
　　研究结论:本研究通过体外体内实验，证实了新型LSD1抑制剂JL1037具有抑制白血病细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡和激活细胞自噬反应等生物学效应，是白血病治疗的潜在有效药物。

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