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课题一：维生素D受体及其基因多态性在再生障碍性贫血发病机制中的作用；课题二：IL-35在获得性再生障碍性贫血中的表达及其作用研究

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课题一 维生素D受体及其基因多态性在再生障碍性贫血发病机制中的作用

第一部分 维生素D受体在获得性再生障碍性贫血免疫失耐受中的作用研究

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

第二部分 维生素D受体基因多态性与获得性再生障碍性贫血的相关性研究

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

课题二 IL-35在获得性再生障碍性贫血中的表达及其作用研究

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述一 难治与复发重型再生障碍性贫血药物治疗研究进展

综述二 Th22细胞在自身免疫性疾病中作用的研究进展

附录

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摘要

本文分为以下两个课题进行探讨：
　　课题一 维生素D受体及其基因多态性在再生障碍性贫血发病机制中的作用
　　第一部分 维生素D受体在获得性再生障碍性贫血免疫失耐受中的作用研究
　　目的:本研究旨在检测1，25(OH)2D3和VDR在AA患者中的表达，同时评价1，25(OH)2D3对AA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的作用，探讨其在AA发病机制中的作用，为AA的免疫抑制治疗提供新的思路。
　　方法:(1)通过ELISA方法检测血浆中25(OH)D3的表达，并进一步分析25(OH)D3水平与AA患者各临床参数之间的关系;(2)通过实时定量PCR的方法检测PBMCs以及1，25(OH)2D3处理后的PBMCs中VDR mRNA的表达水平;(3)通过CCK-8的方法检测1，25(OH)2D3对PBMCs增殖的影响;(4)将患者PBMCs用1，25(OH)2D3处理，未处理组作为对照。48小时后，采用ELISA的方法检测培养上清中TNF-α、IFN-γ、IL-17A、IL-10和TGF-β1的水平变化，实时定量PCR的方法检测T细胞相关转录因子T-bet、GATA3、RORγt和Foxp3mRNA的表达变化，同时采用流式细胞术的方法检测1，25(OH)2D3处理的PBMCs内Th1（CD3+CD8-IFNγ+）、Th2(CD3+CD8-IL4+)、Tc1(CD3+CD8+IFNγ+)、Tc2(CD3+CD8+IL4+)和Th17(CD3+CD8-IL17+)细胞的比例变化。
　　结果:(1)初治AA患者血浆25(OH)D3的水平与完全缓解患者、正常对照组无显著差异;(2)AA患者血浆25(OH)D3的水平与血小板计数、自然杀伤T细胞(naturalkiller T cells，NKT)比例呈显著正相关，与B细胞比例呈负相关;(3)初治AA患者PBMCs VDR mRNA表达水平显著低于正常对照组;(4)体外刺激实验显示1,25(OH)2D3抑制AA患者PBMCs的增殖;(5)外源性1,25(OH)2D3的加入明显抑制AA患者PBMCs分泌TNF-α、IFN-γ和IL-17A，并促进TGF-β1的产生;(6)1，25(OH)2D3抑制Th1、Tc1和Th17细胞的极化，同时促进Th2和Tc2细胞的极化，实时定量PCR的结果进一步证实1，25(OH)2D3抑制AA患者PBMCs内T-bet、RORγtmRNA的表达，同时促进GATA3、Foxp3 mRNA的表达;(7)1，25(OH)2D3处理后正常对照组PBMCs中VDR mRNA的表达水平明显上调，AA患者却无明显变化。
　　结论:初治AA患者PBMCs中VDR表达水平明显降低，低表达的VDR可能使维生素D-VDR通路信号传导减弱，从而导致AA的“高免疫”状态。适量的补充维生素D可通过增强信号传导来部分纠正AA免疫失耐受，有望成为一种新的辅助性治疗策略。
　　第二部分 维生素D受体基因多态性与获得性再生障碍性贫血的相关性研究
　　目的:本研究旨在探讨VDR基因四个多态性位点(rs2228570、rs1544410、rs7975232和rs731236)与AA易感性的关系，并评价VDR基因多态性与AA严重程度、治疗疗效及晚期克隆演变等临床特征的相关性。
　　方法:采集AA患者和正常对照的外周血并提取DNA，采用聚合酶链反应-连接酶检测反应(PCR-LDR)的方法检测197例AA患者和135例健康对照rs1544410(c.1024+283 G＞A)、rs7975232(c.1025-49G＞T)和rs731236(c.1056T＞C)的基因型。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法检测rs2228570(c.2T＞C)的基因型。应用SPSS17.0软件统计分析VDR基因多态性位点与AA易感性、疾病严重程度、治疗疗效、克隆演变及其他临床特征的相关性。
　　结果:(1) VDR基因四个多态性位点的基因型均符合Hardy-Weinberg平衡。(2)VDR基因rs1544410、rs7975232和rs731236三个位点之间存在显著的遗传连锁不平衡。(3)在VDR基因的四个多态性位点中，AA患者rs1544410位点GG基因型和G等位基因频率显著高于正常对照组，而其他三个多态性位点与AA易感性无关。(4)进一步分析发现rs1544410和rs7975232位点与非重型AA的发病相关，而rs2228570位点与重型AA的发病相关。(5) AA患者rs2228570位点的基因型与治疗疗效相关:CC及CT基因型患者预后好于TT基因型者。(6)AA患者rs2228570位点的基因型与晚期克隆演变亦密切相关:TT基因型携带者更易于转化为骨髓增生异常综合征/急性髓系白血病，而CT基因型患者更易进展为阵发性睡眠性血红蛋白尿症。
　　结论:我们的研究结果表明，在中国人群中，VDR基因多态性与AA的易感性、疾病严重程度及预后密切相关。
　　课题二 IL-35在获得性再生障碍性贫血中的表达及其作用研究
　　目的:本研究旨在检测AA患者血浆中IL-35的表达情况，并评估IL-35对T细胞免疫反应的作用，探讨其在AA发病机制中的作用，为基于IL-35的靶向治疗提供理论依据。
　　方法:(1)收集患者临床资料;(2)通过ELISA方法检测血浆中IL-35的表达，并进一步分析IL-35水平与AA患者各临床参数之间的关系;(3)通过实时定量PCR的方法检测外周血单个核细胞(PBMCs)中IL-35两个亚基p35和EBI3 mRNA的表达水平;(4)通过Brdu掺入法检测IL-35对PBMCs增殖的影响;(5)将患者和正常对照PBMCs用IL-35处理，未处理组作为对照。48小时后，采用ELISA的方法检测培养上清中TNF-α、IFN-γ、 IL-17A、IL-10和TGF-β1的水平变化，流式细胞术和细胞计数相结合的方法检测CD4+/CD8+T细胞、Th1(CD3+CD8-IFNγ+)、Th2(CD3+CD8-IL4+)、Tc1(CD3+CD8+IFNγ+)、Tc2(CD3+CD8+IL4+)和Th17(CD3+CD8-IL17+)细胞的比例和绝对数变化，同时采用实时定量PCR的方法检测T细胞相关转录因子T-bet、GATA3、RORγt和Foxp3 mRNA的表达变化。
　　结果:(1)通过ELISA检测，我们发现初治AA患者血浆中IL-35的水平明显低于完全缓解(CR)患者和正常对照组，而CR患者和正常对照组之间无显著差异，进一步分析发现IL-35水平与疾病的严重程度密切相关。(2)在初治AA患者，血浆IL-35的水平与血小板计数、中性粒细胞绝对值和网织红细胞绝对值呈显著正相关，与淋巴细胞比例呈负相关。(3)实时定量PCR的结果显示，初治重型AA患者p35和EBI3 mRNA表达水平低于正常对照组，而初治非重型AA与正常对照组之间无显著差异。(4)体外刺激实验显示IL-35能抑制AA患者PBMCs的增殖，进而行细胞计数和流式细胞术发现IL-35能抑制CD4+和CD8+T细胞的增殖。(5)外源性IL-35的加入明显抑制AA患者PBMCs分泌TNF-α、IFN-γ和IL-17A，同时促进TGF-β的产生。(6)IL-35抑制Th1、Tc1和Th17细胞的极化，同时促进Th2和Tc2细胞的极化，实时定量PCR的结果证实IL-35抑制AA患者PBMCs内T-bet和RORγtmRNA的表达，同时促进GATA3mRNA的表达，对Foxp3 mRNA的表达无明显影响。
　　结论:初治AA患者体内IL-35的表达水平降低，且与疾病严重程度密切相关，IL-35低表达可能致使Tregs失能，进而导致AA的免疫失耐受状态，提示IL-35在AA的发病机制中发挥关键作用。

著录项

  • 作者

    于伟;

  • 作者单位

    北京协和医学院;

    中国医学科学院;

    清华大学医学部;

    北京协和医学院中国医学科学院;

  • 授予单位 北京协和医学院;中国医学科学院;清华大学医学部;北京协和医学院中国医学科学院;
  • 学科 内科学
  • 授予学位 博士
  • 导师姓名 郑以州;
  • 年度 2016
  • 页码
  • 总页数
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 中文
  • 中图分类 R556.502;
  • 关键词

    再生障碍性贫血; 维生素D受体; 基因多态性; 白细胞介素-35; 发病机制;

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