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狂犬病毒感染小鼠脑组织和小胶质细胞的基因表达谱变化及ISG15的抗狂犬病毒作用

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引言

第1章 文献综述

1．1 狂犬病毒的细胞生物学与宿主免疫应答

1．2 小胶质细胞在病毒性中枢神经系统感染疾病中的作用

1．3 ISG15和ISG化(ISGylation)

第2章 狂犬病毒感染小鼠脑组织基因表达谱变化

2．1 材料

2．2 方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第3章 狂犬病毒感染小胶质细胞基因表达谱变化

3．1 材料

3．2 方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5小结

第4章 ISG15和UBA7的抗狂犬病毒作用

4．1 材料

4．2 方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 小结

结论

参考文献

致谢

博士期间发表学术论文和参加学术活动情况

附录

声明

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摘要

狂犬病毒（RABV）为弹状病毒科，狂犬病毒属的负链RNA病毒，具有典型的嗜神经性，是狂犬病的致病原。狂犬病毒感染引发急性致死性脑脊髓炎。据世界卫生组织(WHO)统计，全球每年死于狂犬病的人数超过55000人，其中亚洲占56％，非洲占44％。从1950年至2004年，中国的狂犬病报告病例为108412例。目前，中国的狂犬病发病率仅次于印度，位居世界第二位。
　　 对RABV的研究已逾百年，但RABV确切的致病机理仍不清楚。在RABV与宿主或细胞的相互作用方面，尤其是对RABV感染导致宿主基因表达谱变化以及生物学功能改变的了解还很局限。从细胞和分子水平研究宿主和病毒相互作用是揭示病原体致病机理的重要途径。基因芯片技术可同时检测数以万计基因的表达水平，借助生物信息学方法进行基因表达模式分析、差异表达基因功能聚类、差异表达基因作用路径和网络分析等，从而高效准确的获得病毒感染过程中的宿主反应基因及其相关信息。从基因全景水平研究RABV诱导宿主细胞基因的表达变化对阐明RABV的致病机理具有重要的意义。
　　 本研究利用小鼠全基因组表达谱芯片对RABV感染的脑组织和小胶质细胞进行表达谱分析。在此基础上，对差异表达基因ISG15和UBA7进行抗RABV功能的探索。本研究主要分为三部分：
　　 第一部分：狂犬病毒感染小鼠脑组织中基因表达谱变化。本研究利用基因芯片检测了RABV街毒感染小鼠后脑组织中的基因表达谱变化。结果显示RABV感染引发小鼠脑内390个基因表达上调，2个基因显著下调(P＜0.01)。这些上调的基因包括IFN活化基因（STAT1、STAT3、IRF1、IRF5和IRF7）、IFN信号通路的转录因子(ISG15、MX1、IFIT3、OAS2和OASL2)、趋化因子(CCL9、CXCL10和CCL12)和补体成分（C4A、CIQA、CIQB和CIQC）等。利用DAVID进行Geneontology(GO)分析和KEGGPathways分析。利用IngenuityPathwayAnalysis(IPA)分析平台对差异表达基因进行Network分析。结果表明差异基因参与JAK-STAT信号转导通路、抗原加工与提呈、泛素介导的蛋白降解和补体活化途径等。本实验提示差异表达基因在RABV感染过程中可能具有抗病毒作用，但这些基因也可能促进其发病。
　　 第二部分：狂犬病毒感染小胶质细胞基因表达谱变化。本实验首先评价了RABVCVS-11株在小胶质细胞BV-2中的生长特性。结果显示CVS-11可感染小胶质细胞，但不影响BV-2的细胞活力。结果表明RABV在小胶质细胞中的复制受到严重抑制。本研究利用基因芯片检测了RABV感染小胶质细胞中的基因表达谱变化。结果表明不同感染时间导致小胶质细胞中不同的基因表达谱变化，上调基因显著多于下调基因。RABV感染12h后导致小胶质细胞中28个基因表达显著上调，1个基因显著下调(P＜0.01)；感染24h后导致小胶质细胞中72个基因表达显著上调，24个基因显著下调(P＜0.01)；感染48h后导致小胶质细胞中671个基因表达显著上调，190个基因显著下调(P＜0.01)。RABV感染诱导小胶质细胞中的免疫应答相关基因表达上调，主要包括干扰素激活基因(ISG15、ISG20、OASL1、OASL2、IFIT2、IRF7和IFI203)、趋化因子（CCL5、CXCL10和CCRL2）和促炎症因子(IL-6)等。利用K-means算法将差异表达基因进行表达趋势分析。结果表明根据表达趋势可将差异表达基因分为4个cluster。利用IPA分析平台对差异表达基因进行GO和Network分析。利用DAVID进行KEGGPathways分析。结果表明差异表达基因参与固有免疫应答、炎症反应、抗病毒反应等。本实验表明小胶质细胞在RBAV感染过程中可能是调控免疫应答和炎症反应的重要细胞。
　　 第三部分：干扰素激活基因ISG15及其激活酶UBA7的抗狂犬病毒作用。本研究利用RNAi技术，在体外和体内抑制ISG15及其激活酶E1UBA7的表达，探索ISG15及其激活酶UBA7的抗RABV活性。结果表明，在神经母细胞瘤细胞NA和小胶质细胞BV-2细胞中抑制ISG15及其激活酶UBA7基因表达可提高RABV滴度，并削弱IFN的抗RABV作用；在体内抑制ISG15及其激活酶UBA7基因表达可提高RABV滴度，使小鼠死亡时间提前。本研究表明ISG15及其激活酶UBA7具有抗RABV作用。
　　 通过分析RABV感染后中枢神经系统和小胶质细胞中免疫应答相关基因的表达模式可以加深对RABV致病机理的理解；本研究首次鉴定ISG15及其激活酶UBA7具有抗RABV作用，本研究结果可为探索狂犬病的预防和治疗策略奠定基础。

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