抗人CD33单链抗体及其与CD80胞外区融合蛋白的构建、表达及功能检测

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目的：构建及表达抗人CD33单链抗体(CD33scFv)基因，并检测其生物活性；扩增CD80胞外区，构建ExCD80-CD33scFv融合基因，并在大肠杆菌中表达融合蛋白，进一步检测融合蛋白的生物活性。方法：HIM3—4是血研所研制的分泌鼠源性抗人CD33单克隆抗体的杂交瘤细胞，并已获得国际人类白细胞分化抗原协作组会议正式命名。我们利用RT-PCR技术分别克隆了抗人CD33单克隆抗体HIM3—4的轻、重链可变区基因，并利用短肽(Gly4Ser)。作为linker，通过overlap PCR方法组装成抗人CD33scFv。将获得的抗体基因克隆到具有强启动子的PET28a(+)载体上，应用IPTG诱导表达，纯化的表达产物经证明具有与靶抗原人类CD33特异结合的能力。CD80 DNA序列由王敏教授惠赠，我们通过另行设计带所需酶切位点的引物来扩增CD80胞外区，在此基础上，利用人血清白蛋白(HAS)第三结构域亲水性的403—427位氨基酸作为链间连接肽将抗人CD33单链抗体及人类细胞表面抗原CD80胞外区基因分别经酶切、纯化后克隆至原核表达载体PET22b(+)中，经IPTG诱导，在大肠杆菌内获得了融合蛋白的表达。融合蛋白的成功构建与表达，为下一步探讨血液肿瘤的免疫治疗机制奠定了基础。结果：⑴通过RT-PCR方法，利用通用引物从HIM3—4杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因，分别为321bp和366bp，我们利用(GGGS)。为连接肽构建了抗人CD33基因工程单链抗体，并在PET28a(+)中得到表达，蛋白大小约为31KD，经复性后具有与人CD33结合活性。⑵克隆出CD80胞外区序列，大小为633bp。3利用大小为25Aa的链间链接肽，将CD80胞外区与CD33ScFv连为融合表达基因，并在PET22b(+)中得到表达，蛋白大小约为55KD，经复性后具有与人CD33抗原结合活性。结论：①从HIM3—4杂交瘤细胞中克隆了抗体轻、重链可变区基因，经测序为功能性重排的抗体可变区基因。②用(Gly4Ser)。连接肽基因将VH、VL连接成scFv基因，并用表达载体PET28a(+)表达了scFv蛋白。③扩增了人类ExCD80 cDNA序列，测序显示序列正确。④构建了PET22b(+)—ExCD80-CD33scFv融合基因表达质粒，并在含有稀有密码子的宿主菌Rosetta(DE3)中获得了表达，并探讨了其生物学功能。

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作者
陈小军;
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作者单位

清华大学医学部;

北京协和医学院;

中国医学科学院;

展开▼
授予单位清华大学医学部;北京协和医学院;中国医学科学院;
学科内科学(科研型)
授予学位博士
导师姓名韩忠朝;
年度 2009
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类急性白血病;肿瘤病理解剖学、组织学;
关键词
急性白血病; 单链抗体; 蛋白表达; 病理细胞学;

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