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用于RNA干扰的质粒载体的构建及检测

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摘要

前言

一、实验材料和方法

(一)实验材料

(二)基本实验方法

(三)实验步骤

二、结果和分析

三、讨论

四、小结

参考文献

附录

致谢

个人简历

论文独创性及使用授权声明

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摘要

本课题的目的就在于构建一种在实验室现有条件下易于大量扩增和应用的RNA干扰载体，为后续在人类细胞中进行各种RNA干扰研究奠定基础。我们对克隆载体pUC19质粒进行了改造，使其可以在真核细胞内复制并且具有新霉素抗性标记，然后通过PCR从人类基因组中得到人U6snRNA启动子，将其连入经过改造的pUC19中，构建出RNA干扰质粒pUC19NU。为了检测该质粒诱发的RNA干扰效应，我们针对增强绿色荧光蛋白和p53蛋白的基因，分别设计了两段可以转录出短发夹环状RNA的DNA模板序列，连入载体pUC19NU中，分别转染HeLa细胞和KMB-17细胞。荧光显微镜下不同时段观察HeLa细胞中增强绿色荧光蛋白的表达量，发现所构建的载体几乎可以完全抑制细胞内增强绿色荧光蛋白的表达，并且这种抑制作用是特异的。不同时间收集KMB-17细胞内的蛋白，经WesternBlot检测，发现实验组细胞内p53蛋白的表达量较阴性对照组有显著下降，说明所构建的载体对p53蛋白的表达也有良好的干扰作用，这种干扰效应同样具有特异性。上述实验表明，我们所构建的载体pUC19NU对人类细胞中外源性与内源性的蛋白都具有显著的干扰效果，可以作为以后在人类细胞中进行RNAi实验的载体使用。

著录项

作者
楚莉辉;
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作者单位

北京协和医学院;

清华大学医学部;

中国协和医科大学;

中国医学科学院;

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授予单位北京协和医学院;清华大学医学部;中国协和医科大学;中国医学科学院;
学科分子病毒免疫学
授予学位硕士
导师姓名李琦涵,王丽春;
年度 2005
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类免疫分子生物学（免疫化学）;基因载体;
关键词
RNA; RNA干扰; 质粒载体; RNA干扰载体;

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