基于LC-MSn和基因转录组分析的白茯苓、茯苓皮三萜酸类成分差异及机理研究

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茯苓是多孔菌科真菌(Poria cocos Wolf)的干燥菌核。《黄帝内经》中将其列为上品。在中医临床中，根据入药部位的不同，分为白茯苓（去皮的内核）、茯苓皮（赤褐色外皮）、茯神（包裹了松根的茯苓）。三者功效不同:白茯苓偏于健脾（始载于《神农本草经》）;茯神长于安神（始载于《名医别录》）;茯苓皮擅于利水（始载于《本草纲目》）。三味药来源相同，但功效各异。原因何为？有待揭示。
　　本研究对白茯苓和茯苓皮中三萜酸化学成分进行了定性、定量的比较研究，同时对产生化学成分差异的关键酶基因进行了研究，从化学成分及关键酶基因两个方面探讨造成茯苓皮与白茯苓功效不同的物质基础，为揭示茯苓不同药用部位功效不同的内在原因提供试验依据，也为如何科学解释部分中药“不同部位功效不同”的现象提供研究范例。
　　研究内容如下:
　　1.茯苓三萜酸对照品的制备
　　采用多种色谱技术相结合的方法分离纯化了茯苓皮及白茯苓中的14个三萜酸对照品。经MS、1H-NMR、13C-NMR数据分析，确定了它们的结构，分别为茯苓酸(pachymic acid)、去氢土莫酸(dehydrotumulosic acid)、3-表去氢土莫酸（3-epi-dehydrotumulosic acid）、去氢茯苓酸(dehydropachymic acid)、3-表去氢茯苓酸（3-epi-dehydropachymic acid）、多孔菌酸C(polyporenic acid C)、trametenolic acid、 dehydrotrametenolic acid、依布里酸(eburiconic acid)、去氢依布里酸(dehydroeburiconic acid)、茯苓新酸A(poricoic acid A)、茯苓新酸 B(poricoic acid B)、茯苓新酸 D(poricoic acid D)和5R,8R-peroxydehydrotum ulosic acid。
　　2.茯苓中羊毛甾型三萜酸质谱裂解规律的总结
　　茯苓中羊毛甾烷型三萜酸按结构可分为4类，羊毛甾-△8型(TypeⅠ)、羊毛甾-△7,9(11)-二烯型(TypeⅡ)、3，4-开环-羊毛甾-△8型(TypeⅢ)以及3，4-开环-羊毛甾-△7,9(11)-二烯型(TypeⅣ)。采用轨道离子阱-傅里叶变化质谱对上述对照品进行了裂解规律研究，总结了羊毛甾烷型三萜酸质谱裂解规律:(1)分子量的判定:在正离子检测模式下，C3及C16有羟基取代的三萜酸易生成[M+H-18]+离子;C3羟基取代的三萜酸生成[M+H]+准分子离子峰;在负模式下，易生成[M-H]-准分子离子峰。(2)化合物类型的鉴别:TypeⅠ化合物的特征离子为m/z295; TypeⅡ化合物的特征离子为m/z293;3-氧-7，9(11)-二烯型羊毛甾化合物（如多孔菌酸C）的特征离子为m/z309;在负离子检测模式下，3，4-开环型二萜酸（TypeⅢ和Ⅳ）易生成[M-H-74]或[M-H-88]-特征碎片。(3) C17侧链的鉴别:C9H16O2/C8H14O2(Δm=156/148 Da)为羊毛甾烷型三萜酸C17侧链的中性丢失。根据这一特征数据可确定C17侧链的取代基类型。(4) C3取代基立体异构的判断:茯苓三萜酸C3取代基多有α/β异构，当C3的取代基处于α构型时，碎片[M+H-C16取代基-C17取代基]+的强度大于碎片[M+H-C16取代基-C3取代基]+的强度;反之，则为C-3β取代。
　　3.茯苓皮与白茯苓中三萜酸成分的定性、定量比较
　　采用UHPLC-DAD-FT/MS法对茯苓皮和白茯苓中三萜酸成分进行了定性分析，从茯苓皮中鉴定了27个成分，白茯苓中鉴定了24个成分，包括5组同分异构体（15个化合物），预测了4个可能的新化合物。
　　建立了7 min内同步测定9个二萜酸成分的UHPLC-MS/MS定量分析方法，对6个产地的茯苓皮及白茯苓中三萜酸成分含量进行了测定，结果表明，白茯苓与茯苓皮中的三萜酸含量存在显著差异(p＜0.001)，茯苓皮中9个三萜酸的含量都明显高于白茯苓。运用Simca-P+11软件对上述测定结果进行PCA(Principalcomponent analysis)及PLSD(Partial least squares discriminant analysis)分析方法处理，白茯苓与茯苓皮被明显地聚为两类。去氢土莫酸、trametenolic acid，dehydrotrametenolic acid以及poricoic acid A对白茯苓与茯苓皮的化学成分差异贡献较大。
　　4.茯苓皮与白茯苓基冈转录组初步研究
　　鉴于茯苓皮与白茯苓中开环型三萜酸组成存在显著差异，本文侧重于开环型三萜酸合成酶的研究。采用Illumina Hiseq技术对茯苓皮、白茯苓进行转录组测序。采用功能注释及表达量差异分析对转录组数据进行分析、比对，筛选了与开环型三萜酸合成有关的酶。分别提取云南产6个新鲜茯苓的茯苓皮及白茯苓的总RNA，利用Primer Premier5.0软件设计引物，对产生3，4-开环型三萜酸的关键酶进行了扩增，采用荧光半定量的方法测定关键酶基因在茯苓皮与白茯苓中的表达量，并测定白茯苓与茯苓皮中去氢土莫酸、多孔菌酸C及茯苓新酸B的含量，考察基因表达量与化学成分变化的相关性。实验结果表明:对于不同的茯苓个体，去氧土莫酸与茯苓新酸B含量与所测基因表达量变化趋势相同;多孔菌酸C含量变化趋势与所测基因表达量变化趋势相反。据此推测多孔菌酸C为3，4-开环型三萜酸生物合成的底物，在关键酶基因的作用下产生开环型三萜酸。
　　综上所述，本文首次采用UHPLC-DAD-FT/MS及UHPLC-MS/MS方法对茯苓皮、白茯苓中的三萜酸成分进行定性、定量比较研究，发现开环型三萜酸在茯苓皮中分布更为广泛，揭示了茯苓不同药用部位活性成分的差异。首次对茯苓皮、白茯苓的转录组进行了分析，从分子生物学的角度探讨了茯苓皮与白茯苓成分差异的原因，预测了多孔菌酸C在开环型三萜酸合成中的重要作用，推测了生成3，4-开环型三萜酸的关键酶。

著录项

作者
王维皓;
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作者单位

中国中医科学院;

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授予单位中国中医科学院;
学科中药学
授予学位博士
导师姓名杨滨,王智民;
年度 2015
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总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类植物药;化学分析与鉴定;
关键词
茯苓; 茯苓皮; 白茯苓; UHPLC-MSn; 羊毛甾烷三萜酸; 关键酶基因;

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