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TNF-α预处理骨髓间充质干细胞抑制小胶质细胞活化治疗神经病理性疼痛的研究

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摘要

前言

第一部分：BMMSCs体外培养与鉴定

材料与方法

结果

讨论

第二部分：体外情况下TNF-α预处理BMMSCs对其抑制小胶质细胞活化作用的影响

材料与方法

结果

讨论

第三部分：鞘内注射经TNF-α预处理的BMMSCs对神经病理性疼痛大鼠小胶质细胞及疼痛行为的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

文献综述 改善骨髓间充质干细胞迁移归巢方法的研究进展

攻读硕士学位期间发表文章

致谢

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摘要

神经病理性疼痛(Neuropathic Pain，NPP)发病机制复杂，传统的抗炎药、钙离子通道拮抗剂、三环类抗抑郁药等，在NPP的治疗中非常局限，这使得NPP的治疗成为临床上亟待解决的问题。骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMMSCs)因其独特的生物学特点和优势如：增殖率高、遗传稳定、低免疫原性、免疫调节作用等特点，而直接用于神经病理性疼痛等疾病的治疗。但BMMSCs发挥治疗作用的机制尚不明确。研究表明小胶质细胞(Microglia，MG)在微量促炎因子作用下即可活化，活化后的MG可释放大量主导NPP发生与进展的炎性介质。因此，调节MG过度活化成为治疗NPP的重要途径。研究发现MSCs可被移植微环境中的促炎因子激活，通过自身旁分泌功能抑制MG过度活化进而减轻NPP的发展。但目前促炎因子预处理BMMSCs作用于NPP的研究较少。因此，研究预处理BMMSCs在NPP的发病过程中的作用具有重要意义。
　　实验目的：
　　探讨TNF-α预处理的BMMSCs对CCI大鼠镇痛作用及可能机制
　　实验内容：
　　1、培养并鉴定BMMSCs。
　　2、体外情况下TNF-α预处理BMMSCs对其抑制MG活化作用的影响
　　3、鞘内注射经TNF-α预处理的BMMSCs对CCI大鼠MG活化及疼痛行为的影响
　　实验方法：
　　1、采用贴壁分离法从雄性SD大鼠（3-4周龄）的股骨中分离BMMSCs。光镜下观察细胞形态、流式细胞学技术检测细胞表面标记物对所培养的细胞进行鉴定。
　　2、选择雄性SD大鼠（6-8周龄）120只，参照Bennett法制备CCI模型，随机分为3组(n=40);①CCI组（A组）：造模后第7天鞘内注射不含BMMSCs的PBS20μl;②BMMSC移植组（B组）：造模后第七天鞘内注射含BMMSCs（1×106/只）的PBS20μl;③TNF-α预处理BMMSCs组（C组）：造模后第七天鞘内注射含TNF-α处理后的BMMSCs（1×106/只）的PBS20μl。
　　3、观察各组大鼠在手术前1天，术后第3、7、14、21、28天PWL、PWT。
　　4、分别于手术前一天，术后第3、7、14、21、28天采用颈椎脱臼法处死大鼠，分别取大鼠脊髓(SL)、腰段背根神经节(DRG)。采用ELISA技术检测SL、DRG内TNF-α、IL-6、IL-10炎性因子水平;分别于术后14天取SL、DRG，采用免疫荧光技术检测SL、DRG小胶质细胞表面标记物CD68的表达水平。
　　5、为进一步验证BMMSCs对小胶质细胞的影响，体外情况下采用LPS诱导MG活化，采用共培养的方法来检测BMMSCs对LPS活化后的MG的作用。利用含1000ng/ml的TNF-α完全培养液对BMMSCs进行预处理;利用LPS（10μg/ml）诱导大鼠MG活化。MG分离纯化后，以1×105/孔种植于6孔板中，按以下分组将MG和BMMSCs进行共培养24h。B组（单纯BMMSCs组）、L+B组（LPS+BMMSCs组）、T+B组（TNF-α预处理BMMSCs组）、L+T+B组（LPS+TNF-α预处理BMMSCs组）、M组（单纯MG组）、L+M组（LPS+MG组）、B+L+M组(BMMSCs+LPS+MG组)、T+B+L+M组(TNF-α预处理BMMSCs+LPS+MG组)。
　　6、24h后，取培养液上清，采用ELISA技术检测上清液中TNF-α、IL-6、IL-10等炎性因子表达含量，免疫荧光法检测MG表面标记物CD68抗体的表达水平。
　　实验结果：
　　1、采用贴壁分离法培养的BMMSCs，随着细胞不断传代纯化，细胞形态呈长梭状且呈旋涡状排列，细胞表型鉴定结果如下：CD29表达率99.59％，CD90表达率83.95％，呈阳性;CD34表达率0.1％，CD45表达率7％，呈阴性。
　　2、与CCI组、单纯BMMSC组相比，TNF-α预处理BMMSCs组术前1天、术后28天PWT和PWL差异无统计学意义(p＞0.05);在术后第3天PWT和PWL逐渐降低，术后第7天降至最低，之后缓慢升高，于术后28天恢复至基线水平，在此期间TNF-α预处理BMMSCs术后7、14、21天PWT、PWL值均升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。肉眼可见TNF-α预处理BMMSCs组大鼠精神状态好，术侧伤口恢复较快;与CCI组和单纯BMMSC组相比，差异显著。
　　3、BMMSCs移植后进行ELISA检测发现：TNF-α预处理BMMSCs组腰段脊髓、腰段背根神经节内TNF-α、IL-6等促炎因子含量在术后第3、7天明显升高，术后第14、21天促炎因子含量逐渐降低，术后28天促炎因子含量达到基线水平，与CCI组和单纯BMMSC组相比，差异有明显统计学意义(p＜0.05)。然而，TNF-α预处理BMMSCs组腰段脊髓、腰段背根神经节内抑炎因子IL-10在术后第3、7表达呈低水平，在术后第14天逐渐上升，21天达到高峰，术后28天基本降至术前水平，与CCI组和单纯BMMSC组相比，差异有明显统计学意义(p＜0.05)
　　4、与CCI组和单纯BMMSC组相比，SL、DRG中小胶质细胞CD68表达水平明显降低(p＜0.05)，而CD68在CCI组和单纯BMMSC表达无明显变化。
　　5、L+M组小胶质细胞的CD68表达增高，分泌TNF-α、IL-6含量明显增多;B+L+M组以及T+B+L+M组的小胶质细胞CD68表达水平、TNF-α、IL-6分泌量低于L+M组，且B+L+M组与T+B+L+M组相比有统计学差异(P＜0.05)。
　　实验结论：
　　1、BMMSCs移植调节CCI大鼠的疼痛行为，发挥镇痛作用，经TNF-α预处理BMMSCs镇痛效果更强。
　　2、体外实验下，BMMSCs和经TNF-α预处理的BMMSCs均可抑制LPS诱发的MG的活化且经TNF-α预处理后的BMMSCs对MG活化的抑制作用更强。
　　3、经TNF-α预处理BMMSCs可抑制脊髓小胶质细胞活化并降通过低促炎因子水平、提高抑炎因子水平来减缓CCI大鼠的疼痛行为。

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