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双孔钾离子通道TREK-1和TREK-2功能性串联二聚体载体的构建

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摘要

前言

材料

方法

2．1．TREK-1串联二聚体的构建

2．2．野生型及串联二聚体在非洲爪蟾卵母细胞中的表达

2．3．双电极电压钳记录

2．4．TREK-2串联二聚体的构建和表达

2．5．数据处理与统计分析

结果

3．2．pGH19-TdTREK-1载体表达电流的记录

3．3．TdTREK-1对胞外钡离子的反应

3．4．TdTREK-1对胞外酸化的反应

3．5．TREK-2功能性串联二聚体的构建和表达

讨论

结论

参考文献

综述 双孔钾通道在麻醉和睡眠中作用的研究进展

中英文缩略词表

攻读学位期间发表文章情况

致谢

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摘要

目的：双孔钾离子通道形成二聚体形式发挥功能的特性导致针对其研究的任何操作都会涉及两个亚基，给研究带来诸多不便。本研究旨在探讨分别在两分子双孔钾离子通道TREK-1和TREK-2间加入柔性多肽连接构建串联二聚体载体的可行性。
　　方法：利用PCR技术在两个单体TREK-1分子之间加入柔性多肽连接，构建其串联二聚体载体(pGH19-tdTREK-1)。将上述载体在体外转录成cRNA并显微注射至非洲爪蟾卵母细胞，培养24-48小时后采用双电极电压钳技术记录电流。观察细胞外钡离子和不同pH值外液对该串联二聚体通道表达的影响，并与天然二聚体通道的反应相比较。用上述方法构建TREK-2串联二聚体载体(WT-WT)，观察2-氨基乙基联苯基硼酸酯(2-APB)和胞外酸(pH0)对TREK-2串联二聚体载体通道电流的影响。用蛋白印迹法检测TREK-2和TREK-2串联二聚体在爪蟾卵母细胞和HEK293细胞的蛋白表达。
　　结果：串联二聚体TdTREK-1可在爪蟾卵母细胞中高效表达，该通道形成的电流可被胞外钡离子抑制，也可被胞外液酸化所抑制，并且该串联二聚体通道对这些胞外刺激因素的反应程度与天然二聚体相似。TREK-2串联二聚体载体的电流和药理学特性也与TREK-2天然二聚体相似，且表达出的蛋白确实为串联的二聚体，该二聚体未被降解为单分子形式。
　　结论：人为加入柔性多肽连接序列构建TREK-1功能性串联二聚体和TREK-2功能性串联二聚体载体通道并不影响通道的表达及特性，证明该实验方案可行。这将为我们将来操作单个亚基，进而深入研究TREK-1、TREK-2的结构与功能打下良好的基础。

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