哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2在白介素-35介导T淋巴细胞增殖抑制中的作用及机制

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目的:1.阐明白介素-35(interleukin-35，IL-35)作为免疫调节因子，对T淋巴细胞增殖效应的可能影响。2.探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)在IL-35影响细胞增殖效应中的作用。3.明确mTORC2在IL-35影响细胞增殖中的确切意义及作用机制，为探索脓毒症免疫调控途径提供新线索。
　　方法:以Jurkat细胞作为人T淋巴细胞模型。10％ FBS-RPMI1640完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1×105/ml，取1 ml/孔接种于12孔培养板，采用不同浓度IL-35(10、50、250 ng/ml)于不同时间点(12、24、48 h)予以刺激，刺激前6h予以PMA(50 ng/ml)和Ionomycin(1μM)辅助活化。实验一:采用IL-35刺激后，CCK法检测细胞增殖活性，分析时间/剂量效应关系;流式细胞术检测细胞周期分布，明确IL-35抑制T淋巴细胞增殖反应的方式。实验二:采用Westernblot(WB)法及荧光共聚焦法检测随IL-35刺激剂量的增加，mTORC2核心组分mTOR、Rictor蛋白表达及其下游信号通路蛋白SGK1、p27变化情况，籍以分析mTORC2在IL-35介导T淋巴细胞增殖抑制中的作用。实验三:应用慢病毒转染的方法对mTORC2关键组分Rictor进行调节，构建细胞模型，进而再次应用CCK法对IL-35影响下的细胞增殖情况以及应用WB法对mTOR、SGK1、p27蛋白表达情况进行检测，籍以分析mTORC2及其下游信号蛋白SGK1、p27在IL-35介导T淋巴细胞增殖抑制中的关键作用与调控环节。
　　结果:1.当IL-35剂量达到50 ng/ml和250 ng/ml、刺激12 h后，与对照组比较即呈现明显的增殖抑制现象(P＜0.05）;而10 ng/ml组在刺激时间达24 h和48 h时，Jurkat细胞增殖活性也显著下降（P＜0.05）。流式细胞术结果显示，在IL-35作用下，与对照组相比，更多的细胞停留在G0/G1期(50 ng/ml及250 ng/ml组，P＜0.05)。2.WB结果显示，单独P/I活化的T淋巴细胞会引起mTOR、Rictor、SGK1、p27的磷酸化水平增加(P-mTOR Ser2481，P-Rictor Thr1135，P-SGK1Ser422，P-p27 T157; P＜0.05); IL-35作用下，随剂量的增加，与活化对照组相比，各组蛋白磷酸化水平呈下降趋势(P＜0.05)，而各组非磷酸化蛋白水平无明显差异（P＞0.05）;共聚焦显微镜结果验证了上述变化趋势。3.设计Rictor Thr1135突变慢病毒，构建细胞模型并采用WB验证Rictor表达良好后，检测IL-35作用下模型细胞的增殖及蛋白表达情况。结果显示，干扰Rictor磷酸化位点以后，IL-35介导T淋巴细胞增殖抑制效应显著下降;同时mTORC2核心组分蛋白mTOR及其下游信号通路蛋白SGK1，p27其磷酸化水平与对照组无明显差异。
　　结论:1.IL-35能够以时间/剂量依赖特性对T淋巴细胞增殖产生抑制作用，其效应的发挥与干扰细胞周期分布有关。2.以mTOR和Rictor为核心组分的mTORC2在IL-35介导T淋巴细胞增殖抑制过程中起到关键作用。3.mTORC2-SGK1-p27可能是IL-35调控T淋巴细胞增殖抑制效应的重要信号通路;通过对Rictor蛋白磷酸化位点的调节有助于干扰IL-35介导的增殖抑制效应。

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作者
赵洪强;
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作者单位

解放军总医院;

军医进修学院;

中国人民解放军总医院;

解放军医学院;

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授予单位解放军总医院;军医进修学院;中国人民解放军总医院;解放军医学院;
学科外科学（烧伤）
授予学位博士
导师姓名盛志勇,姚咏明;
年度 2015
页码
总页数
原文格式 PDF
正文语种中文
中图分类 R631.2;
关键词
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体2; 白介素-35; T淋巴细胞; 免疫活性; 脓毒症;

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