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骨癌痛大鼠脊髓背根神经节河豚毒素不敏感钠离子通道表达变化的研究

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骨癌痛是恶性肿瘤相关的慢性疼痛，常伴有静息痛、自发痛、运动触发痛等一系列症状，严重影响了病人的生理功能和心理状况。阿片类药物对骨癌痛缓解作用有限，且有许多副作用。放射疗法虽然对骨癌痛有较好的疗效，但是多数晚期癌症病人身体状况较差，难以耐受放射治疗带来的副作用。因此，深入研究骨癌痛发生发展的病理生理学机制是非常重要的。
　　 研究一,骨癌痛大鼠脊髓DRG神经元中Nav1.8和Nav1.9的表达变化
　　 目的：通过建立大鼠胫骨转移性骨肿瘤模型并研究其DRG神经元上河豚毒素不敏感钠离子通道Nav1.8和Nav1.9的mRNA和蛋白质的表达变化，来探索Nav1.8和Nav1.9在骨癌痛发生发展中的作用。
　　 方法：Sprague-Dawley大鼠56只随机分为三组：假手术组(sham，n=17)，骨癌痛模型7天组(C7，n=17)，骨癌痛模型14天组(C14，n=18)。三组大鼠分别于左后肢胫骨上段髓腔内注射5μL生理盐水(sham组)或1×104/μL walker256鼠源性乳腺癌细胞生理盐水悬浮液(C7组和C14组)，建立癌痛模型。术后密切观察大鼠精神状况并进行运动评分，用CO2激光热刺激仪和Von Frey filament(VFF)细丝测量大鼠左后肢热痛敏缩足阈值(Paw withdrawal threshold，PWT)和机械痛敏缩足阈值的变化并记录大鼠体重。分别于术后7天和14天对大鼠行影像学和病理学检查，以确定瘤组织的生长。在各组观察期结束时，分别取左侧腰4、腰5(L4、L5)DRG。相对定量PCR，免疫印迹和免疫荧光分别用来检测DRG上Nav1.8和Nav1.9的mRNA和蛋白质的表达变化。
　　 结果:实验过程中sham组大鼠体重升高，C7、C14组大鼠于术后5～7天开始出现体重降低。与sham组大鼠相比，C7、C14术侧后肢机械痛敏缩足阈值和热痛敏缩足阈值明显下降，但是非术侧后肢未发现明显差异。病理学图像确认了两癌痛组大鼠胫骨内肿瘤的浸润生长。X线图像表明，C7组胫骨破坏不明显，C14组有明显的骨质破坏，甚至有骨皮质的缺损，癌痛模型成功的比率为32/34。
　　 与sham组相比，C14组Nav1.8和Nav1.9的mRNA相对表达量明显升高(分别是8.9倍和9倍，P<0.01)，但是C7组的mRNA升高无明显统计学意义(分别是1.5和2.4倍，P>0.05)。免疫印迹和免疫荧光的结果表明，与sham组相比较，C14组Nav1.8和NaV1.9的蛋白表达量的升高有统计学意义(P<0.05)，但是在C7组中这两个亚基蛋白表达量没有明显变化(P>0.05)。
　　 结论:大鼠胫骨内注射Walker256细胞可以成功制备胫骨转移瘤模型，此模型大鼠于术后5～7天发生机械痛敏缩足阈值和热痛敏缩足阈值的降低。手术后14天，癌痛组大鼠机械痛敏和热痛敏缩足阈值降低更加显著，并且大鼠脊髓左侧L4、L5DRG上Nav1.8和Nav1.9的mRNA和蛋白质的表达量明显增高，因此提示这两个亚基可能在骨癌痛的发生发展中有一定作用。
　　 研究二,用于膜片钳研究的大鼠背根神经节细胞急性分离技术的改良
　　 目的:通过技术改良，进一步摸索适于膜片钳实验的成年大鼠背根神经节(Dorsalroot ganglion，DRG)细胞的急性分离方法。
　　 方法:采用显微外科技术获取成年大鼠DRG，采用改良的双酶顺序消化及双血清共同培养法，急性分离培养DRG。倒置显微镜下观察神经元的形态，选取已贴壁的细胞，用全细胞膜片钳技术记录其基本膜电生理特。加入河豚毒素(tetrodotoxin.TTX)后再次记录DRG神经元的钠离子电流变化。
　　 结果:本实验可获得形态良好、结构完整的单个DRG神经元，表面光亮，胞膜完整清晰，呈圆形或者椭圆形。其静息膜电位在55.22±4.39 mV范围内，加入TTX后可记录到缓慢失活的河豚毒素不敏感的(tetrodotoxin-resistant，TTX-r)钠离子电流。其中，中等直径DRG神经元高阻封接成功率为73.2％，高于小直径和大直径DRG神经元的封接成功率(P<0.05)。
　　 结论:经改良的DRG急性分离方法分离效率高、可操作性强；分离得到的中等直径DRG神经元状态良好，更适合膜片钳实验。

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