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The DNA binding domain of a papillomavirus E2 programs a chimeric nuclease to cleave human papillomavirus DNA.

机译：乳头瘤病毒E2的DNA结合结构域可对嵌合核酸酶进行编程，以切割人乳头瘤病毒DNA。

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摘要

Viral DNA binding proteins that direct nuclease domains or other functional protein domains to viral DNA in lytically or latently infected cells may provide a novel approach to modulate viral gene expression or replication. Cervical carcinogenesis is initiated by high-risk human papillomavirus (HPV) infection, and viral DNA persists in the cancer cells. To test if a DNA binding domain of a papillomavirus protein can direct a nuclease domain to cleave HPV DNA in cervical cancer cells, we fused the site-specific DNA binding domain of either the bovine papillomavirus type 1 (BPV1) or HPV16 E2 protein to the catalytic domain of the modular FokI restriction endonuclease, generating either a BPV1 E2-FokI (BEF) chimeric nuclease or an HPV16 E2-FokI chimeric nuclease. These chimeric nucleases cleaved DNA substrates containing E2 binding sites in vitro, and only a single E2 binding site was required for cleavage. BEF introduced DNA double-strand breaks on both sides of an E2 binding site in vitro to generate 5' overhangs of 4 nucleotides. Both the DNA binding and catalytic activities of BEF were required for efficient DNA cleavage in vitro. After expression of BEF in HeLa cervical carcinoma cells, we detected cleavage at E2 binding sites 1 and 4 in the integrated HPV18 DNA in these cells. Cleavage was also detected at an E2 binding site in cellular DNA. Expression of BEF in HeLa cells led to repression of the HPV E6 and E7 oncogenes and activation of the p53 and Rb tumor suppressor pathways, resulting in senescence, as measured by growth arrest, altered cellular morphology, increased autofluorescence, and senescence-associated beta-galactosidase activity. This induction of senescence required the DNA binding activity of BEF, but not its nuclease activity. These results demonstrate that DNA binding domains of viral proteins can target effector molecules to cognate binding sites in virally infected cells.
机译：将核酸酶结构域或其他功能性蛋白结构域引导至裂解或潜伏感染细胞中的病毒DNA的病毒DNA结合蛋白可提供调节病毒基因表达或复制的新方法。宫颈癌变是由高危人类乳头瘤病毒（HPV）感染引发的，病毒DNA仍存在于癌细胞中。为了测试乳头瘤病毒蛋白的DNA结合结构域是否可以指导核酸酶结构域切割宫颈癌细胞中的HPV DNA，我们将1型牛乳头瘤病毒（BPV1）或HPV16 E2蛋白的位点特异性DNA结合结构域融合到了宫颈癌细胞上。 FokI限制性核酸内切酶的催化结构域，生成BPV1 E2-FokI（BEF）嵌合核酸酶或HPV16 E2-FokI嵌合核酸酶。这些嵌合核酸酶在体外切割含有E2结合位点的DNA底物，并且仅需要单个E2结合位点进行切割。 BEF在体外在E2结合位点的两侧引入了DNA双链断裂，以产生4个核苷酸的5'突出端。 BEF的DNA结合和催化活性都是有效的体外DNA裂解所必需的。在HeLa宫颈癌细胞中表达BEF后，我们在这些细胞中整合的HPV18 DNA的E2结合位点1和4检测到切割。在细胞DNA的E2结合位点也检测到切割。 BEF在HeLa细胞中的表达导致HPV E6和E7癌基因的抑制以及p53和Rb肿瘤抑制途径的激活，导致衰老（通过生长停滞，改变的细胞形态，增加的自发荧光和衰老相关的β-半乳糖苷酶活性。这种衰老的诱导需要BEF的DNA结合活性，但不需要其核酸酶活性。这些结果表明，病毒蛋白的DNA结合结构域可以将效应分子靶向到病毒感染细胞中的结合位点。

著录项

  • 作者

    Horner, Stacy Michelle.;

  • 作者单位

    Yale University.;

  • 授予单位 Yale University.;
  • 学科 Biology Virology.
  • 学位 Ph.D.
  • 年度 2007
  • 页码 219 p.
  • 总页数 219
  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 eng
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