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隐孢子虫三种实时荧光定量PCR检测方法的比较

         
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摘要

为筛选一种检测谱广、敏感性好、特异性高的隐孢子虫实时荧光定量PCR法,对JVAP18S法、Csp18S法和CRU18S法三种隐孢子虫实时荧光定量PCR方法的敏感性、特异性和重复性进行了检测,并与基于18S rDNA序列的套式PCR方法进行了比较.结果显示,以10倍倍比稀释的含有微小隐孢子虫18S rDNA基因片段的重组质粒为模板,成功地建立了三种实时荧光定量PCR方法;敏感性试验显示,JVAP18S法和Csp18S法最低可检测0.1个卵囊,而CRU18S法最低只能检测到1个卵囊,但他们均比套式PCR方法敏感;特异性试验结果显示,三种实时荧光定量PCR法均可检测微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、泰泽隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri)和贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi),而其他属寄生虫和细菌DNA的检测结果均为阴性;重复性试验结果显示,JVAP18S法、Csp18S法和CRU18S法的批内变异系数分别为0.69%~2.68%、0.11%~4.93%、0.04%~2.89%,批间变异系数分别为0.52%~5.75%、2.09%~5.13%、1.15%~3.71%;对50份小鼠田间粪便样品检测结果显示,JVAP18S法检测的阳性率为84.00%,显著高于套式PCR法检测的64.00%的阳性率.上述结果表明,三种实时荧光定量PCR法均能有效检测隐孢子虫,比较而言,JVAP18S法敏感性高、特异性强、重复性好,尤其适合于隐孢子虫含量较少的样品检测.%In order to select a PCR assay for detection of Cryptosporidium, three real-time PCR assays (JVAP18S, Csp18S and CRU18S) were tested for their sensitivity, specificity and repeatability and also compared with nested PCR based on Cryptosporidium 18S rDNA. The results showed that the 3 real-time PCR assays were developed successfully with serial 10 fold diluted recombinant vector constructed with Cryptosporidium parvum 18S rDNA sequence. The sensitivity testing showed that JVAP18S and Csp18S methods detected as low as 0.1 oocysts while CRU18S method detected 1 oocyst. The specificity testing showed that the 3 real-time PCR assays recognized C. parvum, C. tyzzeri and C. baileyi but did not detect DNAs of Eimeria tenella, Toxoplasma gondii, Schistosoma japonicum, Spirometra mansoni, Escherichia coli, Salmonella typhi and Staphylococcus aureus. The repeatability testing showed that the CV of intro-batch of JVAP18S, Csp18S and CRU18S methods were between 0.69%~2.68%, 0.11%~4.93% and 0.04%~2.89%, respectively, and the CV of inter-batch were between 0.52%~5.75%, 2.09%~5.13% and 1.15%~3.71%, respectively. The positive rate of 50 field mouse samples tested using JVAP18S method was 84.00%, which was higher (p<0.05) than 64.00% with nested PCR assay. These results indicated that these 3 real-time PCR assays could be used for detection of Cryptosporidium. Compared with the other two methods, the JVAP18S method was more sensitive, specific, repeatable and suitable for detection of field samples especially when few parasites were present.

著录项

  • 来源
    《中国动物传染病学报》 |2017年第6期|48-55|共8页
  • 作者

    宋悦; 韩先干; 陈兆国; 赵权; 黄燕; 米荣升; 游艳敏; 贾海燕; 程龙; 张烨华; 张晓丽;

  • 作者单位

    吉林农业大学动物科学技术学院,长春 130000;

    中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室(上海)农业部动物寄生虫学重点实验室,上海 200241;

    中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室(上海)农业部动物寄生虫学重点实验室,上海 200241;

    中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室(上海)农业部动物寄生虫学重点实验室,上海 200241;

    吉林农业大学动物科学技术学院,长春 130000;

    中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室(上海)农业部动物寄生虫学重点实验室,上海 200241;

    中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室(上海)农业部动物寄生虫学重点实验室,上海 200241;

    中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室(上海)农业部动物寄生虫学重点实验室,上海 200241;

    中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室(上海)农业部动物寄生虫学重点实验室,上海 200241;

    中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室(上海)农业部动物寄生虫学重点实验室,上海 200241;

    中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室(上海)农业部动物寄生虫学重点实验室,上海 200241;

    中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物产品质量安全生物性危害因子风险评估实验室(上海)农业部动物寄生虫学重点实验室,上海 200241;

  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 chi
  • 中图分类 S852.723;
  • 关键词

    隐孢子虫; 实时荧光定量PCR; 检测; 敏感性; 特异性; 重复性;

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