柔嫩艾美耳球虫多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2的基因表达及转录动态分析

刘晓丽; 龚振兴; 马雪婷; 曲自刚; 韩政岚; 刘保红; 袁如意; 杨孝朴; 蔡建平

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O-linked glycosylation is a form of protein posttranslational modifications that occurs in the Golgi apparatus of eukaryotes,and archaea as well as bacteria.Polypeptide:N-acetylgalactosaminyltransferase 2 (ppGalNAc-T2,EC 2.4.1.41) is the first key enzyme in the pathway of O-glycan biosynthesis.Whole genome sequencing of Eimeria spp has ever revealed that these protozoa possess the pathways for O-glycan synthesis and O-linked glycosylation of proteins.For exploring the profiles of glycosylation in the global proteome of Eimeria tenella during developmental cycle,and the potential druggable target of EtppGalNAc-T2,we have cloned and recombinantly expressed the EtppGalNAc-T2 gene according to its predicted coding sequence deposited in EuPathDB,and evaluated its transcriptional profiling in different stages of life cycle using qRT-PCR method.The results showed that the ORF of EtppGalNAc-T2 is 1 983 bp in full length,and can be expressed in E.coli Transetta (DE3) with recombinant vector EtppGalNAc-T2-pGEX-6p-1.qRT-PCR results showed that the transcriptions of EtppGalNAc-T2 are significantly varied among different developmental stages,that is,the highest in E.tenella sporozoite,and nearly no-detectable transcription in sporulated occyst.Briefly,these results confirmcd O-glycan synthesis process,and may play roles in the regulation of developmental conversion in E.tenella.%蛋白质翻译后O-糖基化修饰普遍存在于真核生物、细菌和古细菌,多肽:N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(polypeptide:N-acetylgalactosaminyltransferase 2,ppGalNAc-T2)是O-糖基化反应的限速酶.基因组数据分析揭示艾美耳球虫具有O-糖基化反应途径.为研究柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)蛋白质翻译后糖基化修饰及其关键酶的药靶效用,对EtppGalNAc-T2基因进行了克隆,并检测其在E.tenella不同发育阶段的表达动态.根据EuPathDB中所预测EtppGalNAc-T2基因序列设计引物,以RT-PCR方法扩增获得EtppGalNAc-T2的ORF,插入酶切位点后连接到原核表达载体pGEX-6p l进行诱导表达.提取E.tenella广东株未孢子化卵囊、孢子化7h卵囊、孢子化卵囊、子孢子和第二代裂殖子5个发育阶段的总RNA,以qRT-PCR法检测EtppGalNAc-T2转录水平的动态变化.结果表明,EtppGalNAc-T2的全长ORF为1 983 bp,编码660个氨基酸,在E.coli Transetta (DE3)可溶性表达.qRT-PCR结果显示,EtppGalNAc-T2转录水平随发育阶段不同而有显著差异,子孢子阶段表达水平最高、而在孢子化卵囊则几近不能检出.结果为进一步研究EtppGalNAc-T2的功能提供了试验基础.

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来源
《畜牧兽医学报》 |2017年第11期|2173-2180|共8页
作者
刘晓丽; 龚振兴; 马雪婷; 曲自刚; 韩政岚; 刘保红; 袁如意; 杨孝朴; 蔡建平;
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作者单位

甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;

中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046;

江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州225009;

中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046;

江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州225009;

中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046;

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中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046;

江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州225009;

甘肃农业大学动物医学院,兰州730070;

中国农业科学院兰州兽医研究所/家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室,兰州730046;

江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州225009;

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正文语种 chi
中图分类 S852.723;
关键词
柔嫩艾美耳球虫; ppGalNAc-T2; 基因克隆; 表达差异; qRT-PCR;

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