猪日本乙型脑炎病毒DNA复制子载体的构建及外源基因表达分析

王晓杜; 赵凡凡; 代兵; 邵东华; 蒋春英; 周圻; 马志永

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猪日本乙型脑炎病毒(JEV)是引起以母猪流产为主要特征的繁殖障碍性疾病病原之一,笔者拟构建JEV的DNA型复制子载体,并利用该载体表达外源基因.以JEV毒株SA14-14-2为基础,去除病毒结构蛋白基因prM和部分E基因而保留全部非结构蛋白和非编码区序列,插入FMDV2A和丁肝病毒核酶序列构建复制子表达载体pAC-JEV,实时定量PCR、间接免疫荧光、Western blotting方法检测JEV自身蛋白(NS3)表达,验证复制子的自主复制能力.在pAC-JEV的结构蛋白C基因下游插入EGFP基因、猪流感病毒的HA和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒的GP5基因构建重组复制子pAC-J EV-EGFP、pAC-J EV-HA、pAC-JEV-GP5和NS5基因缺失载体pAC-JEV-ANS5,该复制子载体转染BHK-21,荧光显微镜直接观察EGFP表达,Western blotting方法检测外源蛋白质(GFP、GP5、HA)表达情况.结果表明:随着转染时间延长,复制子转染细胞内NS3的表达逐渐增加,表明所构建的JEV复制子表达载体具有自主复制能力.EGFP mRNA转录水平和EGFP蛋白质荧光信号随着转染时间的延长逐渐增加,并且荧光信号可持续8d以上,携带猪流感病毒的HA和猪繁殖与呼吸综合征病毒的GP5基因的复制子载体转染BHK-21细胞后,HA和GP5能有效表达,说明复制子具有表达外源蛋白质的能力.该复制子表达载体的成功构建,为深入研究JEV各蛋白质的功能、各蛋白质与细胞内蛋白质相互作用关系以及基于复制子载体的疫苗开发等提供了技术平台.

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来源
《畜牧兽医学报》 |2015年第1期|111-118|共8页
作者
王晓杜; 赵凡凡; 代兵; 邵东华; 蒋春英; 周圻; 马志永;
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作者单位

浙江农林大学动物科技学院,临安300311;

浙江农林大学动物科技学院,临安300311;

中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;

浙江农林大学动物科技学院,临安300311;

中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;

中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;

浙江农林大学动物科技学院,临安300311;

中国农业科学院上海兽医研究所,上海200241;

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正文语种 chi
中图分类 S852.659.6;
关键词
乙型脑炎病毒; 复制子; 表达载体; HA; GP5;

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