基于CRISPR/Cas9技术的Wip1基因敲除ST细胞的建立

车晶晶; 徐奎; 张秀玲; 向光明; 王楠; 王悦; 刘志国; 牟玉莲; 李奎

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基于CRISPR/Cas9技术的Wip1基因敲除ST细胞的建立

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旨在采用CRISPR/Cas9编辑系统获得Wip1基因敲除的猪睾丸(swine testis,ST)细胞,为后续在细胞水平上探究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响奠定基础.本研究将实验室已有的靶向Wip1基因第一外显子的两条sgRNA(sgWip1-1和sgWip1-2)分别连接到pX330-GFP和pX330-RFP载体,然后共转染ST细胞(从80～90日龄的猪胚胎睾丸组织中分离出未成熟的支持细胞).利用流式细胞仪收集红绿双荧光阳性的ST细胞,以用于单克隆细胞挑选.对得到的30个单克隆细胞进行基因型鉴定,并将PCR产物进行T-A克隆.结果显示,有29个单克隆细胞出现了基因片段敲除,Wip1基因的片段敲除效率为96.7％.其中单等位基因片段敲除的有5个,纯合双等位基因片段敲除的有8个,杂合双等位基因片段敲除的有16个.本研究高效地构建了 Wip1基因敲除的ST细胞,不仅为后续研究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响提供了细胞模型,也为研究Wip1基因对公猪繁殖性能的影响奠定了基础.

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来源
《畜牧兽医学报》 |2021年第10期|2814-2821|共8页
作者
车晶晶; 徐奎; 张秀玲; 向光明; 王楠; 王悦; 刘志国; 牟玉莲; 李奎;
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作者单位

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193;

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193;

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193;

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193;

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193;

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193;

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193;

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193;

中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100193;

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正文语种 chi
中图分类 S828.2;
关键词
CRISPR/Cas9 iWip1基因; ST细胞; 猪;

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