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亚位点-7处突变对碱性芽胞杆菌CGT酶产物特异性的影响

         
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摘要

为了研究来源于碱性芽胞杆菌的γ-环糊精葡萄糖基转移酶(CGT酶)具有较高产物特异性的作用机理,对其氨基酸序列和模拟结构进行了分析,确定其亚位点-7处氨基酸的缺失可能影响其产物特异性.运用重叠PCR的方法,在其亚位点-7处添加缺失的6个氨基酸,造成插入突变.将突变基因与pET-20b(+)连接并在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达.以可溶性淀粉为底物进行酶转化,HPLC分析转化产物中的环糊精含量.结果表明,相对于野生型γ-CGT酶,突变酶转化生成的3种环糊精中,γ-环糊精所占的比例从76.0％降至12.5％,α-、B-环糊精分别从8.7％和15.2％提高至37.5％和50％.分析其可能机理为:与α-、β-CGT酶相比,野生型γ-CGT酶的亚位点-7处缺失6个氨基酸,该构象为葡萄糖的结合提供了更大的空间,从而更适合γ-环糊精的生成；而在其亚位点-7处插入6个氨基酸,造成插入突变后,葡萄糖链结合的空间变小,这种构象不利于γ-环糊精的生成.%To investigate the mechanism of high product specificity of y-clodextrin glucanotransferase (CGTase) from alkalophilic Bacillus clarkii 7364, we aligned protein sequence and structure model, found out that loss of 6 amino acids at subsite -7 probably affected its product specificity. Using overlapping PCR method, we inserted 6 amino acids into subsite -7 pf CGTase. The mutant CGTase gene was ligated with pET-20b (+) and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The extracellular recombinant enzyme was used to transform soluble starch into cyclodextrins (CDs). HPLC analysis results show that, compared to wild CGTase, the y-CDs produced by mutant enzyme decreased from 76.0% to 12.5%, whereas the ratio of a- and 0-CDs increased from 8.7% and 15.2% to 37.5% and 50%. The possible mechanism was that, compared to a-, 0-CGTase, wild y-CGTase lacks 6 amino acids in its subsite -7. This conformation provided more space for glucose combination and was thus advantageous for forming y-CD. When the 6 amino acids were inserted into the subsite -7 of wild y-CGTase, the space to bind with glucose reduced and consequently resulted in less y-CD production.

著录项

  • 来源
    《生物工程学报》 |2012年第2期|191-202|共12页
  • 作者

    杨冬; 田靖斐; 陈晟; 吴敬;

  • 作者单位

    江南大学 食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122;

    江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;

    江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122;

    江南大学 生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;

    江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122;

    江南大学 生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;

    江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122;

    江南大学 生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室,江苏无锡214122;

  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 chi
  • 中图分类
  • 关键词

    环糊精; 环糊精葡萄糖基转移酶; 产物特异性; 突变;

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