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CRISPR/Cas9技术介导Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞系的构建及其三维视网膜类器官培养

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目的 利用CRISPR/Cas9技术构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人胚胎干细胞(ESCs)系及其3D视网膜类器官培养.方法 对H9细胞系靶位点序列进行PCR扩增并测序验证后,利用CRISPR/Cas9技术设计多条sgRNA并对其进行活性检测,根据活性、特异性等因素选择最合适的sgRNA.经酶切鉴定和测序确认打靶载体构建完成后,将打靶载体电转H9细胞系,在hES-ZLM-001基因Exon4和3'-非翻译区之间终止密码子前插入P2A-tdTomato-P2A-iCreERT2,进行药物筛选、阳性克隆富集.设计引物对目标区域进行PCR扩增并测序,根据测序结果和测序峰图选出纯合去抗性敲进阳性细胞克隆.培养所得1-A07细胞系,通过流式细胞分析法检测OCT4阳性细胞比例,采用细胞爬片免疫荧光染色法观察干细胞标志物SOX2、NANOG和SSEA4表达情况.采用核型分析方法检测细胞核型.应用3D培养技术获得视网膜类器官,于分化后不同时间点行冰冻切片,免疫荧光染色法检测不同种类细胞分子标志物的表达分布情况.结果 H9细胞系靶位点序列与Genebank和Ensembl所提供序列一致.根据H9细胞系靶位点序列共设计16条sgRNA,最终选择sgRNA8和sgRNA12作为sgRNA.电转后通过PCR筛选得到4个去抗性敲进阳性克隆,其中1-A07细胞系经流式细胞仪分析OCT4阳性细胞比例约为98.7％,所得细胞系外源性tdTomato-P2A-iCreERT2片段重组位置正确,正常表达干细胞标志物,核型分析结果正常.应用3D培养技术可定向诱导1-A07细胞系分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官.分化后30 d,出现BRN3A阳性神经节细胞、CALBINDIN阳性水平细胞、CHAT阳性无长突细胞,分化后45 d,出现RECOVERIN阳性光感受器细胞,分化后90 d出现PKCα阳性双极细胞.神经节细胞分布于视网膜类器官深层,水平细胞、无长突细胞、双极细胞分布于中深层,光感受器细胞主要分布于顶层.结论 成功构建Crx-iCreERT2红色荧光报告人ESCs系,该细胞系可经3D培养诱导分化为表达tdTomato红色荧光的视网膜类器官.得到的视网膜类器官同人类正常视网膜的神经细胞组成一致,且发育的时间和空间顺序接近于正常的人类视网膜.该细胞系是一种强大的工具,可帮助实现人类视网膜发育和疾病产生的相关研究,并促进致盲疾病治疗方法的开发.

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