大鼠线粒体融合蛋白基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

李文滨; 林泽宇; 陈亚进; 龙天柱; 万云乐; 贾长库

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大鼠线粒体融合蛋白基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

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目的构建并鉴定携带大鼠线粒体融合蛋白（rMfn2）基因的重组腺病毒Ad5-mCMV-增强绿色荧光蛋白（EGFP）-CMV-rMfn2表达载体。方法设计含有NotⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,应用聚合酶链反应（PCR）法扩增目的基因rMfn2,将扩增产物连接到穿梭质粒上,构建重组穿梭质粒pDC316-mCMV-EGFP-CMV-rMfn2。测序鉴定重组穿梭质粒后,与腺病毒骨架质粒pAd5在JM109感受态细胞中同源重组,获得重组腺病毒AD-rMfn2,而后感染HEK293细胞进行包装、扩增、纯化,并测定病毒滴度;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot检测目的基因rMfn2在HEK293细胞中的转录及表达。结果腺病毒穿梭质粒经PCR、双酶切及测序鉴定证明构建正确,目的基因rMfn2正确克隆至腺病毒骨架质粒中;在HEK293细胞中包装、扩增获得了高滴度的重组腺病毒AD-rMfn2,其滴度为4×1013TU/L;AD-rMfn2感染HEK293细胞48 h后,可检测到目的基因rMfn2的转录和蛋白表达。结论成功构建重组腺病毒AD-rMfn2。

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来源
《中华实验外科杂志》 |2014年第2期||共页
作者
李文滨; 林泽宇; 陈亚进; 龙天柱; 万云乐; 贾长库;
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作者单位

1. 中山大学孙逸仙纪念医院肝胆外科 2. 广州市妇幼医院乳腺外科 3. 中山大学附属第六医院肝胆外科 4. 海南医学院附属医院肝胆外科;

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正文语种 chi
中图分类 R346;
关键词
线粒体融合蛋白基因; 重组腺病毒;

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