反向杂交检测乙型肝炎病毒耐药突变方法的优化及其初步评估

刘彦辰; 黄爱龙; 胡源; 胡接力; 赖国旗; 张文露

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目的建立一种HBV耐药突变的反向杂交检测方法 ,并对该方法进行优化和评估。方法针对拉米夫定、阿德福韦酯和恩替卡韦3种药物10个耐药位点的常见耐药突变形式,合成兼顾HBV 8种基因型的26条简并探针,并固定于同一张带正电荷的尼龙膜上,与地高辛标记的待测样本聚合酶链反应（PCR）产物进行杂交。为了提高检测灵敏度和特异性,从PCR产物标记地高辛的数目,紫外交联探针的能量强度,以及杂交和严格洗脱4个方面进行优化。为了证实方法的可行性,从检测特异性、灵敏度和临床标本的检测准确性3个方面进行评估。结果当检测体系为引物标记3个地高辛分子,紫外交联的能量强度选择1500×0.1 mJ/cm~2,杂交温度选择42℃,严格洗脱条件选择44℃,用0.5×SSC和0.1%十二烷基硫酸钠严格洗脱30min时,可获得灵敏、特异的结果。在该检测体系的评估中,当PCR产量在10mg/L以上,可以被检测到,且绝大多数探针特异性较好。临床标本的检测结果与直接测序法的检测结果符合率为93.9%（31/33）。结论该方法可以对HBV拉米夫定、阿德福韦和恩替卡韦耐药突变同时进行检测,是一种简便、快速、灵敏的分析方法 ,但部分探针的特异性有待进一步提高。对于180/181、202/204这4个位点的探针,由于两两距离较近,同一探针序列包含2个位点的密码子,杂交会相互干扰,通过组合距离较近的2个位点的密码子的各种形式来设计探针,可能有助于取得更好的结果。

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来源
《中华肝脏病杂志》 |2011年第12期||共页
作者
刘彦辰; 黄爱龙; 胡源; 胡接力; 赖国旗; 张文露;
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作者单位

1. 重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室 2. 首都医科大学附属北京友谊医院;

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正文语种 chi
中图分类传染病;
关键词
肝炎病毒; 乙型; 寡核苷酸序列分析; 核苷(酸)类似物; 耐药; 反向杂交;

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