乙型肝炎病毒DNA聚合酶中核糖核酸酶RNase H反式调节基因DNAPTP4的克隆化研究

王春花; 朗振为; 成军; 吴煜; 杨艳杰; 张黎颖; 党晓燕

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目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术筛选乙型肝炎病毒(HBV)核糖核酸酶RNase H蛋白反式激活基因差异表达的cDNA,克隆RNase H反式激活相关靶基因.方法:以RNase H表达质粒pcDNA3.1(-)-RNase H转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析,其未知基因片段通过Kozak规则和多聚腺苷酸信号序列,初步确定.以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序加以证实.结果:该新基因被命名为DNAPTP4,在GenBank中注册,注册号为AY450392.DNAPTP4基因的编码序列全长为828个核苷酸(nt),编码产物由276个氨基酸残基(aa)组成.结论:应用SSH技术成功筛选与克隆RNase H反式激活新型靶基因DNAPTP4,为进一步阐明RNase H反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.

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来源
《中西医结合肝病杂志》 |2004年第6期|339-342|共4页
作者
王春花; 朗振为; 成军; 吴煜; 杨艳杰; 张黎颖; 党晓燕;
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作者单位

首都医科大学北京佑安医院病理科,北京,100054;

首都医科大学北京佑安医院病理科,北京,100054;

中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心;

中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心;

中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心;

中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心;

中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心;

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正文语种 chi
中图分类 R512;
关键词
肝炎病毒,乙型; RNase H蛋白; 反式激活; 基因克隆化;

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