一种实用的β-分泌酶表达、纯化和活性鉴定方法

朱瑞; 伍巧燕; 张兴梅; 高小芳; 卫佩如; 张馨宇; 王方

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一种实用的β-分泌酶表达、纯化和活性鉴定方法

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目的探讨一种在常用真核细胞系中表达、纯化和鉴定阿尔茨海默病（AD）相关蛋白-β-分泌酶（BACEl）的方法。方法在从人脑基因库中获取BACEI序列并成功扩增的基础上,将其插入带有增强绿色荧光蛋白（EOFP）的表达载体pEGFP-c3中。将BACE1/pEGFP-c3重组质粒用脂质体转染至HEK293细胞中表达。再通过TALON亲和色谱法分离纯化及酶切得到BACE1蛋白。用Westemblotting及荧光共振能量共振转移（FRET）法鉴定BACE1的表达和体外活性。同时将BACE1/pEGFP-c3质粒与表达淀粉样前体蛋白（APP）的重组质粒（APP/pDsRed-Monomer-N1）共转染HEK293细胞,再以Western blotting法检测BACE1切割底物APP的效果。结果（1）实验获得的BACE1基因与GenBank中的序列一致。（2）活性测定表明,空白对照组、标准BACE1阳性对照组、纯化的BACE1实验组的荧光强度分别为55.013±3.597、2639.548±207.190和1836.629±154.195,差异有统计学意义（F=78.681,P=0.000）,其中后2组差异无统计学意义（P＞0.05）。（3）Westem blotting结果显示转染的BACE1在细胞内可切割底物APP并产生CTF-APP条带。结论本实验方法可成功获取BACE1基因片段并在HEK293细胞中高效表达,同时具备生物学活性,可为AD临床药物的开发提供物质基础。

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来源
《中华神经医学杂志》 |2015年第6期||共页
作者
朱瑞; 伍巧燕; 张兴梅; 高小芳; 卫佩如; 张馨宇; 王方;
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作者单位

1. 南方医科大学神经生物学教研室 2. 宁夏人民医院重症监护室 3. 南方医科大学第一临床医学院;

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正文语种 chi
中图分类 R749.16;
关键词
阿尔茨海默病; β-分泌酶; 真核细胞;

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