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首页> 中文期刊> 《中华神经医学杂志》 >骆驼蓬总碱通过诱导细胞自噬促进Tau蛋白和α-突触核蛋白的降解

骆驼蓬总碱通过诱导细胞自噬促进Tau蛋白和α-突触核蛋白的降解

         
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目的探讨骆驼蓬总碱（TAH）能否诱导神经细胞自噬并促进神经毒性蛋白Tau蛋白和α-突触核蛋白（α-Syn）的降解。方法 （1）将体外培养的PC12细胞分为空白对照组及1、2.5、5、10、20、50 μg/mL TAH组, 分别加入0、1、2.5、5、10、20、50 μg/mL TAH作用24 h, 观察细胞形态及数目的变化, 采用MTT法检测细胞存活率;（2）将PC12细胞分为空白对照组、雷帕霉素组及1、2.5、5、10、20 μg/mL TAH组, 分别加入等量溶剂、50 nmol/L自噬激活剂雷帕霉素及1、2.5、5、10、20 μg/mL TAH作用4 h, 采用免疫荧光染色检测细胞自噬体数;（3）将PC12细胞分为空白对照组、雷帕霉素组、10 μg/mL TAH组, 分别加入等量溶剂、50 nmol/L雷帕霉素、10 μg/mL TAH作用4 h, Western blotting检测细胞p62和微管相关蛋白1轻链3（LC3）-Ⅱ蛋白的表达;（4）将PC12细胞分为空白对照组、氯喹组、TAH组、TAH+氯喹组, 分别加入等量溶剂、50 nmol/L自噬抑制剂氯喹、10 μg/mL TAH、10 μg/mL TAH+50 nmol/L氯喹作用4 h, Western blotting检测细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达;（5）将PC12细胞分为TAH组和空白对照组, 分别加入10 μg/mL TAH和等量溶剂处理4 h后, Western blotting检测细胞磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、磷酸化p70核糖体蛋白S6激酶（p-p70S6K）的表达;（6）将过表达Tau-绿色荧光蛋白（GFP）的Tet on HEK293细胞分为空白对照组、TAH组、强力霉素组、强力霉素+TAH组、强力霉素+TAH+3-甲基腺嘌呤（3-MA）组、强力霉素+TAH+氯喹组, 后4组细胞加入200 ng/mL强力霉素处理24 h后, 空白对照组加入等量溶剂, TAH组加入10 μg/mL TAH, 后3组细胞分别加入10 μg/mL TAH、10 μg/mL TAH+5 mmol/L 3-MA、10 μg/mL TAH+50 nmol/L氯喹, 作用24 h后在激光共聚焦显微镜下观察细胞绿色荧光强度的变化, Western blotting检测细胞Tau-GFP和LC3-Ⅱ蛋白的表达;（7）将稳定表达α-Syn的HEK293细胞分为空白对照组、氯喹组、TAH组、TAH+氯喹组, 分别加入等量溶剂、50 nmol/L氯喹、10 μg/mL TAH、10 μg/mL TAH+50 nmol/L氯喹作用24 h, Western blotting检测细胞α-Syn和LC3-Ⅱ蛋白的表达。结果 （1）与空白对照组比较, 20、50 μg/mL TAH组细胞存活率降低, 且50 μg/mL TAH组细胞存活率低于20 μg/mL TAH组, 差异均有统计学意义（P＆0.05）;（2）与空白对照组比较, 雷帕霉素组、10、20 μg/mL TAH组细胞自噬体数增多, 且10 μg/mL TAH组细胞自噬体数多于20 μg/mL TAH组, 差异均有统计学意义（P＆0.05）, 因此, 选择10 μg/mL TAH用于后续实验;（3）与空白对照组比较, 雷帕霉素组、TAH组细胞p62蛋白的表达均降低, LC3-Ⅱ蛋白的表达均增加, 差异均有统计学意义（P＆0.05）;（4）与空白对照组比较, 氯喹组、TAH组、TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达均增加, 且TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达高于氯喹组, 差异均有统计学意义（P＆0.05）;（5）与空白对照组比较, TAH组细胞p-mTOR、p-p70S6K的表达均降低, 差异均有统计学意义（P＆0.05）;（6）强力霉素组细胞Tau-GFP蛋白的表达较空白对照组增加, 强力霉素+TAH组细胞Tau-GFP蛋白的表达较强力霉素组降低, 强力霉素+TAH+3-MA组、强力霉素+TAH+氯喹组细胞Tau-GFP蛋白的表达较强力霉素+TAH组增高, 差异均有统计学意义（P＆0.05）。TAH组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较空白对照组增加, 强力霉素+TAH组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较强力霉素组增加, 强力霉素+TAH+3-MA组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较强力霉素+TAH组降低, 强力霉素+TAH+氯喹组细胞LC3-Ⅱ蛋白的表达较强力霉素+TAH组增高, 差异均有统计学意义（P＆0.05）;（7）与空白对照组比较, TAH组HEK293细胞α-Syn蛋白的表达降低, LC3-Ⅱ蛋白的表达升高, 差异均有统计学意义（P＆0.05）;TAH+氯喹组细胞LC3

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