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油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位、原核表达及其酶活分析

         
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摘要

为了研究油菜乙酰乳酸合酶基因BnALS3的亚细胞定位与酶学特性,以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品系N131为材料,采用RT-PCR法克隆到BnALS3的cDNA序列.该序列含有一个长度为1959bp的开放阅读框,编码蛋白为652个氨基酸,在N端含有一个由49个氨基酸残基组成的叶绿体信号肽序列.将该信号肽序列构建至植物表达载体35S::BnALS3-GFP,利用拟南芥原生质体细胞进行瞬时表达,结果显示BnALS3蛋白定位在叶绿体中.构建去除叶绿体信号肽序列的BnALS3原核表达载体pCzn1-BnALS3,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达.SDS-PAGE和Western Blot检测显示,在11℃条件下以终浓度为0.2mmol·L-1的IPTG诱导8h后,pCzn1-BnALS3基因在大肠杆菌中成功表达,融合蛋白His-BnALS3呈部分可溶性,分子量约为67kD.酶活分析表明,原核表达的His-BnALS3最适反应pH值为7.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为6.55mmol·L-1和6.40μmol·mg-1·h-1.%To understand the subcellular location and enzymatic characteristics,BnALS3(acetolactate syn-thase)from Brassica napus L.was investigated.A full length cDNA of BnALS3 gene was cloned from rapeseed line N131 by RT-PCR.The open reading frame of BnALS3 was 1 959 bp in length,which encoded a 652-amino acids sequence with a putative chloroplast transit peptide including 49 amino acid residues at N-terminal end.The transit peptide DNA was cloned for plant-expressed vector p35S::BnALS3-GFP construction.Transient expres-sion from transformed protoplasts of Arabidopsis thaliana showed that BnALS3 protein was mainly located in chloro-plast.Bacterial expression vector pCzn1-BnALS3(without chloroplast transit sequence)was constructed and ex-pressed in Escherichia coli strain BL21(DE3).SDS-PAGE and Western blot showed that the recombinant protein was successfully induced to express under 0.2 mmol·L-1 of IPTG at 11℃ for 8h.Recombinant His-BnALS3(about 67 kD)could be detected in both lysate supernate and precipitates.Enzyme activity assay indicated that under the optimal condition of pH 7.0 and temperature of 37℃,His-BnALS3 had Km6.55mmol·L-1and Vmax 6.40μmol·mg-1·h-1,respectively.

著录项

  • 来源
    《中国油料作物学报》 |2018年第3期|309-317|共9页
  • 作者

    胡茂龙; 龙卫华; 高建芹; 陈锋; 周晓婴; 张维; 陈松; 张洁夫; 浦惠明;

  • 作者单位

    江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花与油菜重点实验室/国家油料作物改良中心南京分中心,江苏 南京,210014;

    江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花与油菜重点实验室/国家油料作物改良中心南京分中心,江苏 南京,210014;

    江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花与油菜重点实验室/国家油料作物改良中心南京分中心,江苏 南京,210014;

    江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花与油菜重点实验室/国家油料作物改良中心南京分中心,江苏 南京,210014;

    江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花与油菜重点实验室/国家油料作物改良中心南京分中心,江苏 南京,210014;

    江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花与油菜重点实验室/国家油料作物改良中心南京分中心,江苏 南京,210014;

    江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花与油菜重点实验室/国家油料作物改良中心南京分中心,江苏 南京,210014;

    江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花与油菜重点实验室/国家油料作物改良中心南京分中心,江苏 南京,210014;

    江苏省农业科学院经济作物研究所/农业部长江下游棉花与油菜重点实验室/国家油料作物改良中心南京分中心,江苏 南京,210014;

  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 chi
  • 中图分类 油菜籽（芸薹）;
  • 关键词

    油菜; 乙酰乳酸合酶; 叶绿体信号肽; 亚细胞定位; 融合蛋白; 原核表达; 酶活;

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