原核表达

摘要： 为了连续测定乙酰辅酶A合成酶(acetyl-CoA synthetase,ACS)催化的乙酰辅酶A(acetyl coenzyme A,Ac-CoA)合成,探讨以醛醇脱氢酶(aldehyde/alcohol dehydrogenase,AdhE)为偶联酶检测ACS活性的可行性.以大肠杆菌(Escherichia coli K12)基因组为模板扩增、克隆AdhE基因,通过原核表达、纯化获得AdhE,对其进行了酶学动力学分析,并进一步以AdhE为偶联酶对ACS活性进行了测定.结果发现:AdhE的kcat为13.8 min-1,Ac-CoA和NADH的Km分别为52.8和73.4μmol·L-1;ACS的kcat为10.5 min-1,乙酸和ATP的Km分别为1.31和0.15 mmol·L-1.表明基于AdhE的Ac-CoA检测体系切实可用,为Ac-CoA合成反应的连续测定奠定了良好的基础.

摘要： 为了解泛素羧基端水解酶5基因(ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L5,UCHL5)在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)卵巢发育中的作用,本研究采用RACE技术克隆了脊尾白虾UCHL5全长cDNA,并对其在脊尾白虾不同组织和不同卵巢发育时期的表达情况进行分析,在此基础上构建了pET32a-UCHL5原核表达载体,进行诱导表达研究.结果 显示,UCHL5 cDNA全长为1440 bp,共编码329个氨基酸,预测其相对分子量为37.57 kDa,理论等电点为5.51.系统进化分析表明,脊尾白虾UCHL5氨基酸序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)同源性最高(83％),与同为甲壳纲的凡纳滨对虾、拟穴青蟹(Scylla paramamosain)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)聚为一支.荧光定量PCR分析结果显示,UCHL5在鳃中的表达量最高,其次是卵巢,且在以上2种组织中的表达量均显著高于其他组织;在卵巢不同发育时期,UCHL5的表达呈先上升后下降的趋势,在产后恢复期(V期)急剧下降至最低水平.构建的UCHL5原核表达载体在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功表达UCHL5融合蛋白.本研究结果表明,UCHL5可能与脊尾白虾卵巢发育有密切关系,为研究甲壳动物卵巢发育的分子调控机制提供了理论基础.

摘要： 为了制备人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)23亚型的L1蛋白,结合大肠杆菌密码子偏好性,经密码子优化合成HPV23的L1蛋白编码区序列,并将其分别克隆至原核表达载体,成功构建了4种原核表达载体pET28a-23L1、pET30a-23L1、pET32a-23L1和pESUMO-23L1,随后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经SDS-PAGE鉴定发现,pESUMO-23L1和pET32a-23L1均能表达可溶性重组蛋白,且pESUMO-23L1的可溶性表达量较高.利用Ni-NTA亲和层析法纯化重组SUMO-23L1蛋白,纯度约为90％.血凝实验结果表明,重组SUMO-23L1蛋白具有类似天然病毒的血凝活性.

摘要： 抗体是蛋白质功能研究的重要试剂.玉米蛋白的功能研究因缺乏相应的抗体而难以开展.玉米淀粉合酶IIb与淀粉合酶Ⅱa均属于淀粉合酶,其主要负责支链淀粉的延伸.但对淀粉合酶Ⅱb的报道较少,本研究以原核表达的淀粉合酶IIb的C端(455～704 aa)GST融合蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,分离血清制备SSIIb多克隆抗体.Western blot试验发现,SSIIb多克隆抗体不但能识别SSIIb-C(455～704 aa)抗原,而且能识别玉米不同发育阶段胚乳中SSIIb蛋白.利用该多克隆抗体的Western blot试验表明,玉米SSIIb蛋白的表达在授粉后10 d到30 d的胚乳中表达模式是先增后降,授粉后15 d表达量最高,而半定量RT-PCR的结果表明授粉后20 d SSIIb的转录水平最高.这些结果表明成功制备了特异的玉米SSIIb的多克隆抗体,并能在Western blot中特异识别玉米内源SSIIb蛋白,为进一步深入研究SSIIb蛋白功能奠定基础.

摘要： 抗体是蛋白质功能研究的重要试剂。玉米蛋白的功能研究因缺乏相应的抗体而难以开展。玉米淀粉合酶IIb与淀粉合酶IIa均属于淀粉合酶,其主要负责支链淀粉的延伸。但对淀粉合酶IIb的报道较少,本研究以原核表达的淀粉合酶IIb的C端(455~704 aa)GST融合蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,分离血清制备SSIIb多克隆抗体。Western blot试验发现,SSIIb多克隆抗体不但能识别SSIIb-C(455~704 aa)抗原,而且能识别玉米不同发育阶段胚乳中SSIIb蛋白。利用该多克隆抗体的Western blot试验表明,玉米SSIIb蛋白的表达在授粉后10 d到30 d的胚乳中表达模式是先增后降,授粉后15 d表达量最高,而半定量RT-PCR的结果表明授粉后20 d SSIIb的转录水平最高。这些结果表明成功制备了特异的玉米SSIIb的多克隆抗体,并能在Western blot中特异识别玉米内源SSIIb蛋白,为进一步深入研究SSIIb蛋白功能奠定基础。

摘要： 抗体是蛋白质功能研究的重要试剂。玉米蛋白的功能研究因缺乏相应的抗体而难以开展。玉米淀粉合酶Ⅱb与淀粉合酶Ⅱa均属于淀粉合酶,其主要负责支链淀粉的延伸。但对淀粉合酶Ⅱb的报道较少,本研究以原核表达的淀粉合酶Ⅱb的C端(455~704 aa) GST融合蛋白为抗原,免疫新西兰大白兔,分离血清制备SSⅡb多克隆抗体。Western blot试验发现, SSⅡb多克隆抗体不但能识别SSⅡb-C (455~704 aa)抗原,而且能识别玉米不同发育阶段胚乳中SSⅡb蛋白。利用该多克隆抗体的Western blot试验表明,玉米SSⅡb蛋白的表达在授粉后10 d到30 d的胚乳中表达模式是先增后降,授粉后15 d表达量最高,而半定量RT-PCR的结果表明授粉后20 d SSⅡb的转录水平最高。这些结果表明成功制备了特异的玉米SSⅡb的多克隆抗体,并能在Western blot中特异识别玉米内源SSⅡb蛋白,为进一步深入研究SSⅡb蛋白功能奠定基础。

摘要： 【目的】克隆鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus,AngHV)ORF87基因,分析其序列特征并制备多克隆抗体,为揭示ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用机制提供技术支持。【方法】根据GenBank已公布AngHV参考株(NC_013668)的ORF87基因序列设计引物,从AngHV-FJ株基因组中扩增出ORF87基因,构建重组质粒pMD19-ORF87经酶切鉴定和测序验证后,采用Softberry、ProtParam、CDD、TMHMM、SignalP 5.0、PSORT及BepiPred等在线软件进行生物信息学分析;将ORF87基因克隆至p ET-32a表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达后进行SDS-PAGE检测及Western blotting鉴定;以纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备ORF87多克隆抗体。【结果】克隆获得的AngHV-FJ株ORF87基因为2127 bp,与GenBank已发布的参考序列高度同源(相似性为99.72%),仅存在4个碱基突变;其编码蛋白分子量为80.1 kD,理论等电点(pI)为7.62,不稳定系数为42.38,总平均亲水性为-0.271。ORF87蛋白具有蛋白激酶C超家族(PKC-like Superfamily)的保守结构域,但不具信号肽和跨膜结构域;其亚细胞定位可能位于细胞核和细胞质膜,存在19个潜在B细胞抗原表位,即具有良好的免疫原性。AngHV-FJ株ORF87基因可在大肠杆菌中高效表达,表达获得的融合蛋白约100.0 kD,主要以包涵体形式存在;以融合蛋白免疫新西兰大白兔制备获得的ORF87多克隆抗体效价达1∶16000,能特异性识别AngHV的ORF87蛋白。【结论】AngHV-FJ株源ORF87基因经原核表达载体诱导表达获得的融合蛋白ORF87具有Serine/threonine蛋白激酶活性,以其免疫新西兰大白兔制备获得的ORF87多克隆抗体具有高效价,能特异性识别AngHV感染,可作为亚细胞定位及表达时相分析等蛋白特性研究的工具,用于解析ORF87基因在AngHV侵染过程中的作用。

摘要： 本试验旨在制备牦牛早孕因子(early pregnancy factor,EPF)多克隆抗体,为牦牛妊娠早期高效快速诊断技术研究奠定基础。采用RT-PCR方法,从牦牛胎盘和卵巢组织中提取RNA,反转录为模板后进行EPF基因扩增,并将其克隆到改造后的载体pET28-His10-Sumo上,构建pET28-His10-Sumo-EPF重组质粒,经PCR和测序鉴定后将阳性重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)中。用IPTG诱导表达并优化表达条件,使用His标签镍柱纯化重组EPF蛋白并免疫小鼠制备抗体。结果显示,经PCR扩增的牦牛EPF基因在300 bp左右,符合预期结果,并通过测序验证获得重组阳性质粒。pET28-His10-Sumo-EPF重组质粒转化后经IPTG的诱导,表达分子质量大小为29 ku的蛋白(其中包括早孕因子目标蛋白和SUMO标签蛋白),且在37°C、IPTG浓度为300 nmol·L^(-1)、诱导6 h时获得最高表达量。Western blot结果显示,蛋白在上清和包涵体中均有表达,免疫后的小鼠抗血清能够与纯化后的重组蛋白发生免疫反应。本试验通过原核表达系统成功表达了重组牦牛EPF蛋白,制备了免疫原性较好的鼠抗EPF多克隆抗体。

摘要： 为制备单核细胞增生李斯特菌SigB蛋白及其多克隆抗体,采用PCR方法扩增参考菌株10403S的sig B基因片段,并克隆至原核表达载体pET-30a构建重组质粒,测序验证后转化至大肠杆菌Rosseta(DE3)感受态细胞进行原核表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化Sig B蛋白,通过免疫兔体获得多克隆抗体。结果表明:成功构建SigB重组质粒,并诱导表达出可溶性Sig B蛋白,其相对分子质量约30 ku,纯化后的SigB蛋白质量浓度约为1.5 mg∕mL,获得的多克隆抗体效价为1∶51200。经Western-blot验证,该多克隆抗体能特异性检测Sig B蛋白,表现出良好的抗体特异性。本研究可为探究单增李斯特菌的应激调控机制奠定基础。

摘要： 本试验旨在运用分子生物学与生物信息学方法对布鲁氏菌DnaJ蛋白进行分析;将该蛋白进行原核表达,并检验纯化蛋白在体外或体内诱导Th1和Th2型免疫反应的能力。以布鲁氏菌M5-90为模板成功扩增目的基因DnaJ,构建重组表达载体pET-30a-DnaJ;利用SDS-PAGE检测DnaJ重组蛋白在大肠杆菌中的表达,并对其进行纯化;用DnaJ蛋白刺激RAW 264.7细胞和小鼠脾细胞,并用DnaJ蛋白免疫小鼠;利用ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ、IL-4及小鼠血清中IgG1和IgG2a抗体水平的变化。结果显示,DnaJ蛋白二级结构以无规则卷曲结构为主,该蛋白有11个抗原决定簇;SDS-PAGE结果显示,重组菌在37.7 kDa大小的位置有特异表达条带,获得了DnaJ纯化蛋白;DnaJ蛋白可诱导宿主细胞和小鼠产生高水平IFN-γ、IL-4、IgG1和IgG2a抗体。鉴于DnaJ蛋白可在体外或体内诱导Th1和Th2型免疫反应,有望成为布鲁氏菌病的候选亚单位疫苗。

摘要： 为制备新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)XX株σB蛋白的多克隆抗体,试验经RT-PCR扩增NDRV XX株σB基因编码序列,构建原核表达质粒pET-32a(+)-σB,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导获得His-σB重组蛋白.SDS-PAGE显示成功表达出约55ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,其表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度分别为3h和0.25mmol/L.经Ni2+柱亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白,将蛋白经Western blotting和蛋白质谱鉴定为高纯度的σB重组蛋白,将纯化后σB重组蛋白按合理免疫程序免疫家兔,获得多抗隆抗体经Western blotting分析显示出特异性的反应.本试验结果为后续NDRVσB蛋白功能的深入研究及基因工程疫苗的研发奠定了基础.

摘要： 本研究从本实验室已有刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)转录组数据中筛选获得α-微管蛋白基因片段,利用5'RACE和3'RACE首次克隆获得其cDNA全长为1602bp,包含1356bp的开放阅读框,编码451个氨基酸,预测蛋白质为49.78kD,生物信息学分析表明其为亲水性非跨膜蛋白,氨基酸序列的第142-148位有特异且保守的GTP核苷酸结合位点(GGGTGSG).对刺激隐核虫α-微管蛋白氨基酸序列进行同源性比对及进化树分析,发现其与间日疟原虫(Trypanosoma vivax)、丹氏锥虫(T.danilewskyi)、八肋游仆虫(Euplotes octocarinatus)、尾刺耐格里原虫(Naegleria gruberi)、眼虫(Euglena gracilis)等的序列一致性高达94-95％,且在系统进化树上聚为一支.采用实时荧光定量PCR技术对α-微管蛋白基因在刺激隐核虫三个生活史阶段的表达进行检测,结果显示α-微管蛋白基因的表达量在纤毛虫时期显著高于包囊和滋养体时期(P＜0.05).进一步地,我们构建了α-微管蛋白重组表达载体,并转化至大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)和Rosetta(DE3)中进行原核表达,SDS-PAGE分析表明,诱导表达的重组蛋白分子量约为50kD,与预测的结果一致,即成功诱导表达α-微管蛋白.本实验结果为后续制备α-微管蛋白有效亚单位疫苗防治刺激隐核虫病奠定了基础.

摘要： 副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是猪的条件性致病菌,常引起以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎等为特征的格拉泽氏病,严重危害养殖业的发展.虽然抗生素对该病有一定的治疗效果,但长期使用也导致细菌耐药性越来越严重,因此疫苗仍然是控制该病的最佳手段.3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)是HPS的一个外膜蛋白,可以促进B细胞和T细胞的增殖,具有重要的免疫调节作用,可以作为新型DNA疫苗的候选蛋白.本研究以副猪嗜血杆菌标准5型血清菌株的基因组DNA为模板,利用PCR技术克隆得到GAPDH片段,将其和原核表达载体pET28a都进行双酶切处理后,在T4连接酶的作用下连接得到重组质粒pET28a-GAPDH,经验证无误后,将其导入大肠杆菌BL21中,在IPTG的诱导下进行原核表达.结果表明,重组菌株可以在含有卡那霉素的LB平板上长出单菌落,菌液PCR可以扩增出1020bp大小的外源基因片段,说明GAPDH原核表达载体构建成功.通过SDS-PAGE实验可以看到,重组菌株BL21(pET28a-GAPDH)在IPTG的诱导下表达出带有His标签的,大小约为37KDa的3-磷酸甘油醛脱氢酶蛋白,与理论值相符,应用镍离子亲和交换柱进行蛋白的纯化,纯化后得到的蛋白含量约为0.988mg/mL,证明GAPDH基因可以在原核表达系统中得到有效表达且蛋白纯化后蛋白含量较高.

摘要： 目的：原核表达人骨唾液酸蛋白蛋白,建立胶体金免疫层析检测方法.rn 方法：构建pET15b-BSP原核表达载体,转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中进行诱导表达.筛选BSP抗体,建立胶体金免疫层析检测方法检测人骨唾液酸蛋白,并对检测方法进行方法学评价.rn 结果：成功构建E.coli BL21(DE3)-pET15b-BSP原核表达菌,经过表达条件优化,重组人BSP主要以可溶性蛋白形式存在,经过纯化、浓缩得到纯度为96.3％、浓度为7.44mg/ml的BSP蛋白,经过SDS-PAGE分析重组BSP分子量约为37kDa.利用重组BSP及多对抗体,建立ELISA方法筛选具有良好特异性、不同表位的高效抗体对,建立胶体金定性检测方法,有效检测范围100ng/ml-300ng/ml,4°C可保存10个月.利用试纸条验证重组BSP抗原性.rn 结论：通过研究得到了具有良好抗原性的重组人BSP,初步建立了BSP胶体金免疫层析快速半定量检测方法,为临床快速检测血清BSP提供了理论基础和技术保障.

摘要： 目的:从独行菜Lepidium apetalum中克隆强心苷合成途径的法尼基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPS)基因,并在大肠杆菌中表达. 方法:分析前期获得的独行菜幼苗转录组数据,选择其中注释为FPS且具有完整开放阅读框的序列,从独行菜叶片cDNA中通过PCR克隆该序列,并进行序列分析.将该基因通过pET-32a载体在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达. 结果:克隆得到独行菜FPS基因的cDNA序列,GenBank登录号KY366218,命名为LaFPS.序列含有1161bp的开放阅读框,推测编码386个氨基酸.构建的载体pET-32a-LaFPS在大肠杆菌中成功诱导表达. 结论:成功克隆了独行菜FPS基因,并建立了原核表达体系,为独行菜强心苷合成途径的进一步研究提供了基础.

摘要： 为制备新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)XX株σB蛋白的多克隆抗体,试验经RT-PCR扩增NDRV XX株σB基因编码序列,构建原核表达质粒pET-32a(+)-σB,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,经IPTG诱导获得His-σB重组蛋白.SDS-PAGE显示成功表达出约55ku的融合蛋白,主要以包涵体形式存在,其表达时的最佳诱导时间、IPTG诱导浓度分别为3h和0.25mmol/L.经Ni2+柱亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白,将蛋白经Western blotting和蛋白质谱鉴定为高纯度的σB重组蛋白,将纯化后σB重组蛋白按合理免疫程序免疫家兔,获得多抗隆抗体经Western blotting分析显示出特异性的反应.本试验结果为后续NDRVσB蛋白功能的深入研究及基因工程疫苗的研发奠定了基础.

摘要： 2016年-2017年间,一种新型猪病病原-猪急性腹泻综合征病毒(SADS-CoV)在广东省清远市养猪场引发了一系列严重的疫情,造成24693头仔猪的死亡.为了分离和鉴定SADS-CoV病毒,对其基因组特征进行解析并建立快速检测方法,本研究拟通过RT-PCR方法对病料进行扩增,获得的阳性病料接种Vero细胞,分离和纯化SADS-CoV病原,测定病毒的全长基因组序列并进行生物信息学分析;通过RT-PCR方法扩增SADS-CoV N蛋白基因,原核表达并制备鼠源单克隆抗体,在此基础上建立诊断病原的胶体金试纸条检测方法.SADS-CoV是一种全新的猪肠道冠状病毒,不与目前猪场流行的冠状病毒的抗体产生交叉反应,提示现有的猪冠状病毒疫苗对其感染可能无效,所以及时分离到该病毒、了解其基因组特征并建立病原快速检测方法对于我国新生仔猪腹泻的防控及病原致病机制研究具有重要意义.

摘要： 本研究运用利用生物信息学软件预测了猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea virus,PEDV)S1蛋白的1个B细胞中和线性表位.为了验证S1蛋白中该中和线性表位的存在,并鉴定其中和活性,本研究构建了含有该B细胞线性表位截短S1基因的重组质粒pGEX-4T-S1,通过蛋白电泳和Westernblotting确定该重组质粒可以在原核细胞表达,将该重组蛋白纯化,免疫BALB/c小鼠,三次免疫后,眼眶静脉采血进行间接免疫荧光及中和试验.蛋白电泳、Westem blotting和间接免疫荧光试验结果表明,截短S1蛋白能够在大肠杆菌BL21(DE3)中获得表达,并能够引起机体的体液免疫反应;中和试验结果表明,该免疫血清能有效中和PEDV,中和效价为1∶64.该研究结果对猪流行性腹泻病毒免疫机制和新型疫苗的研究具有重要的借鉴意义.

摘要： 目的:构建汉坦病毒Hunan03株核蛋白基因原核重组表达载体,在大肠杆菌中进行核蛋白表达,研究核蛋白的免疫性及免疫反应性. 方法:设计特异性扩增汉坦病毒Hunan03株S基因完整开放阅读框(ORF)的引物,RT-PCR扩增,产物克隆到pGM-T载体,转化感受态细胞TOP10,应用蓝白斑筛选、酶切、PCR鉴定,定向克隆到pGEX-6p-2原核表达载体,转化Ecoli.BL21StarTM(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot对重组蛋白进行鉴定.应用Glutathione Sepharose4B纯化柱纯化重组蛋白,免疫新西兰兔,建立间接ELISA法对核蛋白的免疫原性与免疫反应性进行评价. 结果:PCR扩增S基因ORF区域产物大小约1306bp,重组载体Pgex-6p-2-S经双酶切、PCR、测序鉴定提示构建成功;在37°C,IPTG浓度为0.8mmol/L诱导5h的条件下,表达出最高量的相对分子量约74kDa的GST-NP融合蛋白.建立的间接ELISA法检测GST-NP融合蛋白免疫后的新西兰兔血清,IgM抗体滴度达1:8000,IgG抗体滴度达1:16000. 结论:成功构建了高效表达的汉坦病毒S基因重组表达载体,获得了纯度较高具有较好的免疫原性与免疫反应性的核蛋白,为后续汉坦病毒单克隆抗体的制备奠定了基础.

摘要： 牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus,IBRV)是牛传染性鼻气管炎的病原体,IBRV壳膜蛋白VP8在病毒复制及致病过程中发挥重要作用.本研究将表达IBRV VP8基因的重组表达质粒pET-32a-VP8转化入表达宿主Transetta(DE3)菌株内,采用37°C,IPTG浓度为1.0mol/L诱导表达.将表达产物通过镍离子亲和层析纯化.然后将纯化的VP8融合蛋白免疫Babl/c小鼠制备抗血清.结果表明,重组蛋白VP8以包涵体的形式存在,其相对分子质量约110kDa,Western-blot分析结果表明:该蛋白与抗IBRV的血清能发生特异性反应,以其所制备的抗血清与IBRV及病毒壳膜蛋白VP8特异性结合.研究结果说明,获得的IBRV VP8蛋白具备良好的免疫原性,所制备的抗血清将为研究IBRV致病机理奠定基础.

摘要： 本发明提供了一种高效表达重组牛成纤维细胞生长因子‑2(rbFGF‑2)的方法。本发明首先根据大肠杆菌密码子使用偏好性，对FGF2基因序列的密码子进行替换，设计合成了rbFGF‑2核苷酸序列全长，构建得到能够表达rbFGF‑2蛋白的表达载体，将该表达载体与分子伴侣质粒先后导入到同一大肠杆菌中进行共表达。本发明解决了原核生物与真核生物在密码子使用偏好上存在差异，导致外源基因在大肠杆菌体内不能高效表达的问题；同时，通过与分子伴侣共表达，增进目标蛋白质稳定性，显著提高了rbFGF‑2蛋白的产量和活性。

摘要： 本发明涉及用T7启动子改造原核固氮基因，使之适应于真核表达。

摘要： 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M+N双基因的原核融合表达载体。通过PEDV的M和N基因片段，利用Blunt‑E2表达载体，通过无缝克隆技术，构建出表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体，并提供了其在基因工程蛋白重组表达中的应用。本发明是直接将纯化PEDV的M基因片段连接到Blunt‑E2哺乳动物原核融合表达载体中，不需要连接至单克隆载体PMD19‑T中，然后M+Blunt‑E2质粒通过同源重组技术，无缝拼接N基因片段，从而获得M+N双基因融合表达载体，其质粒通过PCR技术进行鉴定，测序准确后再转染在细胞中获得成功表达。因此，该原核融合表达载体的制备比较其他原核融合表达技术，具有操作步骤简单、反应时间短等特点。

摘要： 本发明提供了一种高效表达重组牛成纤维细胞生长因子‑2(rbFGF‑2)的方法。本发明首先根据大肠杆菌密码子使用偏好性，对FGF2基因序列的密码子进行替换，设计合成了rbFGF‑2核苷酸序列全长，构建得到能够表达rbFGF‑2蛋白的表达载体，将该表达载体与分子伴侣质粒先后导入到同一大肠杆菌中进行共表达。本发明解决了原核生物与真核生物在密码子使用偏好上存在差异，导致外源基因在大肠杆菌体内不能高效表达的问题；同时，通过与分子伴侣共表达，增进目标蛋白质稳定性，显著提高了rbFGF‑2蛋白的产量和活性。

摘要： 本发明公开了一种利用原核表达系统表达纯化多肽的方法，所述方法为：将多肽单元的C端加上肠激酶酶切位点，N端加上组氨酸标签，获得重组多肽单元；然后从N端到C端依次将若干个重组多肽单元串联，获得重组蛋白的氨基酸序列；将重组蛋白的编码基因导入大肠杆菌，构建重组大肠杆菌；重组大肠杆菌诱导表达后，湿菌体用缓冲液重悬破碎后，提取重组蛋白；重组蛋白采用肠激酶处理后，获得多个多肽单元。本发明通过在要表达的短肽之间加上肠激酶的酶切位点，利用肠激酶处理最后可以保证得到大小和序列统一的目的短肽，有效的克服了无法利用原核系统表达多肽的难题。

摘要： 本发明公开了将人双调蛋白克隆至人工改造的表达载体pGEX‑4T‑1及其原核可溶性表达的研究成果，解决了真核外源基因在原核表达系统内易形成包涵体的问题。通过切除原核表达载体pGEX‑4T‑1上GST（谷胱甘肽转移酶）标签，添加促溶标签SUMO，构建重组质粒pGEX‑SUMO；然后将人双调蛋白基因AREG克隆至重组质粒pGEX‑SUMO上；再对目标蛋白可溶性表达条件进行优化，分离纯化出重组天然蛋白SUMO‑AREG；最后对SUMO‑AREG酶切去除标签，进一步纯化获得重组蛋白AREG。本发明能生产出具有天然结构的重组蛋白AREG，对后期人双调蛋白的生理功能的研究提供一个好的基础。

摘要： 本发明公开一种奶牛溶菌酶基因的原核表达载体构建方法，属于基因工程领域，将奶牛LYZ基因mRNA序列翻译为cDNA序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，采用双酶切获得目的片段、pET32a载体片段，将目的片段和pET32a载体片段连接，构建LYZ‑pET32T原核表达载体。本发明通过人工设计并合成LYZ基因CDS序列，将其克隆至表达载体pET32T并转化大肠杆菌TOP10，筛选阳性菌株，经IPTG诱导，初步纯化表达产物，并对其进行SDS‑PAGE分析。本发明成功的构建原核表达载体LYZ‑pET32T，纯化分离得到奶牛溶菌酶蛋白，为后续研究与应用奠定了基础。

摘要： 本发明公开了一种提高人金属硫蛋白MT1b原核表达载体表达量的方法。该方法包括：人工合成密码子优化的MT1b？DNA分子，该分子还包括DNA内切酶识别序列NcoI、SpeI、NheI；将所述DNA分子构建到pET28a(+)的NcoI/NheI克隆区；再经过系列重组使包含核糖体结合区的MT1b编码基因扩增到4拷贝。本发明的方法适用于所有小分子多肽(100个氨基酸以内的)表达载体的构建，整个过程操作简单，快速，所制备的原核表达载体提高了MT1b蛋白的表达量，降低了成本，提高了工作效率。

摘要： 本发明公开了一种提高人金属硫蛋白MT3原核表达载体表达量的方法。该方法包括：人工合成密码子优化的MT3的DNA分子，该分子还包括DNA内切酶识别序列NcoI、SpeI、NheI；将所述DNA分子构建到pET28a(+)的NcoI/NheI克隆区；再经过系列重组使包含核糖体结合区的MT编码基因扩增到4拷贝。本发明的方法适用于所有小分子多肽(100个氨基酸以内的)表达载体的构建，整个过程操作简单，快速，所制备的原核表达载体提高了MT3蛋白的表达量，降低了成本，提高了工作效率。

摘要： 本发明公开了一种提高人金属硫蛋白MT2a原核表达载体表达量的方法。该方法包括：人工合成密码子优化的MT2a？DNA分子，该分子还包括DNA内切酶识别序列NcoI、SpeI、NheI；将所述DNA分子构建到pET28a(+)的NcoI/NheI克隆区；再经过系列重组使包含核糖体结合区的MT编码基因扩增到4拷贝。本发明的方法适用于所有小分子多肽(100个氨基酸以内的)表达载体的构建，整个过程操作简单，快速，所制备的原核表达载体提高了MT蛋白的表达量，降低了成本，提高了工作效率。