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首页> 中文期刊> 《中国病理生理杂志》 >稳定低表达GSNOR细胞系Neuro-2a的构建及其对S-亚硝基化的影响

稳定低表达GSNOR细胞系Neuro-2a的构建及其对S-亚硝基化的影响

         
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目的:探讨转染慢病毒载体构建稳定低表达S-亚硝基谷胱甘肽还原酶(S-nitrosoglutathione reductase,GSNOR)的小鼠神经母细胞瘤Neuro-2a细胞系,并考察稳定低表达GSNOR对S-亚硝基化修饰水平的影响。方法:构建靶向GSNOR的慢病毒载体,用LipoFiter脂质体转染Neuro-2a细胞,并用嘌呤霉素筛选稳定低表达GSNOR的细胞系。光镜观察Neuro-2a细胞的形态变化,CCK-8法检测转染不同时间后的细胞活力,RT-qPCR和Western blot检测GSNOR的mRNA和蛋白表达水平。生物素转换法检测转染后Neuro-2a细胞内总S-亚硝基化蛋白水平。结果:HBLV-m-ADH5-shRNA1-PURO慢病毒载体序列与目的序列结果一致,提示慢病毒载体构建成功。嘌呤霉素筛选后,光镜观察Neuro-2a细胞形态良好,CCK-8实验结果显示在24、48、72和96 h时点细胞活力无显著差异,提示转染对细胞活力无明显影响。转染第2、4和6代后细胞内GSNOR mRNA水平分别是空载病毒组的37.02%、40.66%和30.13%,均显著降低(P<0.01),GSNOR蛋白表达水平较空载病毒组亦显著下降(P<0.01)。此外,稳定低表达GSNOR的Neuro-2a细胞中蛋白S-亚硝基化修饰水平显著上调(P<0.01)。结论:稳定低表达GSNOR的Neuro-2a细胞系构建成功,GSNOR低表达可上调胞内总蛋白的S-亚硝基化修饰水平。

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