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同时检测六种人类冠状病毒的单管多重RT-PCR方法的建立

         
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目的建立一种单管多重RT-PCR检测方法,同时检测6种人类冠状病毒。方法由GenBank获取6种人类冠状病毒（HCoV-NL63、HCoV-229E、SARS-CoV、HCoV-OC43、HCoV-HKU1和MERS-CoV）的核苷酸序列作为参比,分别设计6种冠状病毒保守区靶序列特异性引物,用本实验室所保存的病毒株及核酸样本为模板建立基于全自动电泳仪分析的单管多重RT-PCR检测技术,进行了检测限和重复性评价,并用本实验室所保存的其他呼吸道病毒阳性样品对该方法的特异性进行了再验证。用140份临床样本结合荧光定量RT-PCR法平行验证了该检测方法的可行性。结果基于全自动电泳仪分析的多重RT-PCR检测技术可同时检测6种人类冠状病毒,阳性标本均显示至少一条相应特异性产物预期大小片段（分别为195、304、332、378、415、442 bp）,阴性对照无特异性条带显示,具有较高的特异性。在检测单个病毒时检测限能达到1.0×10~1~1.0×10~2拷贝/μl。其他呼吸道病毒验证未发现交叉反应。140份临床样本平行验证结果与常用的单一HCoV检测的荧光定量RT-PCR法一致,阳性样本均为28份（20%）。结论建立的基于全自动电泳分析的单管多重PCR方法能够同时检测6种人类冠状病毒感染,有较高的灵敏度和特异性。

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