宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究

刘晓萌; 苏文强; 郑永辉; 李苏楠

首页> 中文期刊> 《中国预防兽医学报》 >宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究

宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究

开具论文收录证明 >>

期刊封面封底目录下载 >>

文献代查 >>

页面导航

摘要
著录项
相似文献
相关主题

摘要

严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)S蛋白与宿主表面受体ACE2结合后,S蛋白中的Furin裂解位点RRAR被宿主细胞内的弗林蛋白酶(Furin)识别,并将S蛋白切割为S1/S2亚基。为研究Furin对SARS-CoV-2S蛋白的切割活性、对病毒的感染性及其形成细胞-细胞膜融合(合胞体)的影响,本研究采用套式PCR分别扩增S蛋白Furin裂解位点突变(将裂解位点由RRAR分别突变为RRRR、SRAS和AAAA)的编码基因片段,并分别克隆至pCAGGS载体中,构建重组质粒pRRRR-Flag、pSRAS-Flag、pAAAA-Flag,均经酶切和测序鉴定正确后构建pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA质粒并经测序鉴定。采用慢病毒包装系统包装慢病毒后感染Huh7细胞,48 h后采用杀稻瘟菌素筛选共表达ACE2和TMPRSS2的Huh7细胞系Huh7-A+T;利用CRISPR-Cas9方法构建Furin敲除(Furin-KO)细胞系,并均经western blot鉴定。结果显示,上述两种细胞均正确构建。将与Flag融合表达的RRAR、RRRR、SRAS和AAAA质粒分别转染HEK293T细胞,24 h后利用western blot检测S蛋白的表达。将pRRAR-Flag和pFurin-His共转染HEK293T细胞;同时将pRRAR-Flag分别转染HEK293T和Furin-KO细胞,24 h后利用western blot检测上述两种细胞中S蛋白的表达。结果显示,转染pRRAR-Flag的细胞中检测到S蛋白和S2亚基的表达,即Furin能够切割S蛋白,但转染pAAAA-Flag和pSRAS-Flag的细胞中均检测不到S2亚基的表达,转染p RRRR-Flag的细胞中S2亚基的表达量增加。与仅转染pRRAR-Flag的对照细胞相比,在HEK293T细胞中共转染pFurin-His和pRRAR-Flag能够显著增加S蛋白切割为S2亚基的量;而在Furin-KO细胞中未检测到S2亚基的表达。采用假病毒系统包装Furin裂解位点RRAR及其突变体(SRAS、AAAA)的假病毒SARS-CoV-2;利用HEK293T和Furin-KO细胞包装SARS-CoV-2假病毒,通过计算荧光素酶活性Luc与各病毒p24蛋白含量的比值比较不同假病毒对Huh7-A+T细胞及内源性Furin对两种细胞包装的假病毒的相对感染性。结果显示,与pRRAR-Flag及HEK293T细胞包装的假病毒相比,pSRAS-Flag和pAAAA-Flag及Furin-KO细胞包装的假病毒对Huh7-A+T细胞的感染性均极显著降低(P<0.01)。将质粒pEGFP-RRAR、pEGFP-RRRR、pEGFP-SRAS、pEGFP-AAAA与pEGFP-Furin分别转染HeLa细胞,24 h后经激光共聚焦显微镜观察Furin蛋白和S蛋白在细胞中的定位;将前4种质粒与表达Furin-His的质粒共转染HeLa细胞,24 h后经间接免疫荧光试验(IFA)检测Furin蛋白和S蛋白及其突变体在细胞中共定位。观察结果可见,Furin蛋白主要位于细胞浆中,S蛋白与Furin裂解位点突变的S蛋白均位于细胞膜;IFA结果显示,Furin与S蛋白及Furin裂解位点突变为RRRR的S蛋白在细胞浆中均存在共定位,但与Furin裂解位点突变为AAAA的S蛋白不存在共定位。将pRRAR-Flag、pSRAS-Flag分别与pCAGGS-m Cherry共转染HEK293T细胞,同时利用细胞示踪剂(CMFDA)预处理Huh7-A+T细胞1 h后将两种细胞混合培养,24 h后观察结果显示,共转染pRRAR-Flag和pCAGGS-m Cherry的HEK293T中出现明显的合胞体,而当Furin裂解位点突变为SRAS时,合胞体的形成明显减少。本研究首次证实Furin在细胞浆中对S蛋白预切割,且将S蛋白的Furin裂解位点突变为SRAS后能够降低SARS-CoV-2的感染性和细胞合胞体的形成能力。本研究为新冠疫情的防治提供新思路。

著录项

来源
《中国预防兽医学报》 |2023年第7期|672-681|共10页
作者
刘晓萌; 苏文强; 郑永辉; 李苏楠;
展开▼
作者单位

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室;

展开▼
原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类家畜病毒学;
关键词
严重急性呼吸综合征冠状病毒2; 弗林蛋白酶; 刺突蛋白; S2亚基切割; 共定位;

相似文献

中文文献
外文文献
专利

1. 中药复方防感汤对SARS-CoV-2刺突蛋白引起的肺和结肠上皮细胞损伤的保护作用与TGF-β/Smad2/3和NF-κB通路的调节有关 [J] . 黄超 ,刘浩生 ,梁炳君 . 中国医学科学杂志:英文版 . 2023,第3期
2. 严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)刺突蛋白的B细胞及T细胞抗原表位的生物信息学分析 [J] . 陶佳 ,李莎莎 ,杨继辉 . 细胞与分子免疫学杂志 . 2023,第1期
3. 弗林蛋白酶裂解位点在微生物感染宿主中的作用 [J] . 高明燕 ,姜逸 ,程旭 . 养殖与饲料 . 2021,第10期
4. SARS-CoV-2侵袭宿主细胞的关键蛋白酶TMPRSS2的生物信息学分析 [J] . 张利娜 ,文朝朝 ,杜相欣 . 中国人兽共患病学报 . 2021,第8期
5. 宿主蛋白CD1d通过网格蛋白介导的内吞作用影响ASFV侵入宿主细胞 [J] . CHEN XIN ,ZHENG JUN ,LIU CHUAN-XIA . 中国预防兽医学报 . 2023,第6期
6. 利用感染性克隆与体外突变技术研究刺突蛋白在SARS病毒致病机制中的作用 [C] . 韩剑峰 ,陈水平 ,姜涛 . 第九届全军流行病学、第八届全军防生物危害医学专业学术会议 . 2007
7. 弓形虫感染宿主细胞磷酸化蛋白质组学分析及宿主细胞蛋白vimentin在弓形虫感染过程中的作用机制研究 [A] . 何成 . 2018

宿主细胞弗林蛋白酶对SARS-CoV-2刺突蛋白切割作用的研究

摘要

著录项

相似文献

相关主题

期刊订阅