人类O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶蛋白的亚细胞荧光定位

赵淑兰

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人类O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶蛋白的亚细胞荧光定位

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目的:机体对烷化剂诱导基因突变的修复能力取决于细胞内O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶的含量及合成速度.构建人类O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因与增强型绿色荧光蛋白基因融合表达的载体,根据荧光分布确定其亚细胞定位.方法:实验于2006-12/2007-06在南阳医学高等专科学校生理学实验研究中心完成.参考人类O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶的基因序列和p-EGFP-N1载体的多克隆位点设计PCR扩增引物.从Hela细胞中提取总RNA,反转录合成O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶的cDNA,进而合成双链DNA.扩增后的DNA目的片段与p-EGFP-N1载体均行Nhel和BamHI双酶切,回收,定量后用T4连接酶连接,产物转化大肠杆菌感受态细胞TOP10,挑选阳性克隆并提取质粒测序,构建成功的质粒绿色荧光蛋白位于O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶蛋白的C末端.将pEGFP-N1-MGMT载体分别转染HEK293和Hela细胞,荧光显微镜下与转染空载体pEGFP-N1的细胞进行对比观察,荧光信号表达最高点时进行固定并对细胞核进行复染,观察亚细胞定位情况,同时免疫印迹分析蛋白的表达.结果:①RT-PCR检测:扩增的O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因cDNA片段约为650 bp,与预期相符.②克隆及序列鉴定:扩增的DNA片段与载体pEGFP-N1经过Nhel和BamHI双酶切后,可连接得到重组的表达载体,命名为pEGFP-N1-MGMT.重组质粒的酶切产物有650 bp,4 700 bp两条带,克隆结果正确.该质粒经测序确认正确.③免疫印迹分析:转染pEGFP-N1质粒的细胞表达增强型绿色荧光蛋白,相对分子质量约为27 000;转染pEGFP-N1-MGMT融合蛋白质粒的细胞相对分子质量约为49 000,证明目的蛋白在转染细胞内表达成融合蛋白.④亚细胞定位:转染pEGFP-N1质粒的细胞绿色荧光信号均匀分布于整个细胞.转染pEGFP-N1-MGMT质粒的细胞绿色荧光主要集中在胞质,特别在一定条件下核周围有颗粒样聚集.结论:①实验成功构建pEGFP-N1-MGMT融合蛋白质粒.②人类O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因定位在胞浆,且在一定条件下可以在核周聚集.

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来源
《中国组织工程研究》 |2007年第33期|6589-6593|共5页
作者
赵淑兰;
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作者单位

南阳医学高等专科学校生理教研室,河南省南阳市,473061;

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正文语种 chi
中图分类 R394.25;
关键词
人类O6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶基因; 增强型绿色荧光蛋白; RT-PCR; 亚细胞定位;

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