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BDNF和NT-3慢病毒载体构建与相对表达水平比较

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目的构建携带脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、融合基因(BDNF-T2A-NT-3)的慢病毒载体,通过感染人源骨髓间充质干细胞(hBMSCs)检测BDNF和NT-3的mRNA和蛋白相对表达水平。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术扩增制备BDNF、NT-3、BDNF-T2A-NT-3目的基因片段,离体构建携带BDNF、NT-3、BDNF-T2A-NT-3的慢病毒表达载体并感染293T细胞;采用PCR技术检测293T细胞中BDNF、NT-3和BDNF-T2A-NT-3 mRNA相对表达水平;采用流式细胞术检测hBMSCs免疫表型;将对数生长期的hBMSCs随机分为hBMSCs组、空载慢病毒组、BDNF组、NT-3组和融合基因组,分别用空载慢病毒、BDNF慢病毒载体、NT-3慢病毒载体、BDNF-T2A-NT-3慢病毒载体感染后,于倒置相差显微镜下观察细胞荧光强度;采用荧光PCR法和蛋白免疫印迹法检测BDNF、NT-3的mRNA和蛋白的相对表达水平。结果测序分析鉴定结果显示,成功构建了携带BDNF、NT-3、BDNF-T2A-NT-3的慢病毒载体。慢病毒感染293T细胞后在倒置相差显微镜可观察到绿色荧光,感染目的基因组293T细胞的BDNF、NT-3和BDNF-T2A-NT-3 mRNA相对表达水平均高于无感染目的基因组(P值均<0.01)。流式细胞术检测结果显示,hBMSCs中分化抗原(CD)73;、CD90;、CD34;阳性表达率分别为97.77%、52.15%和0.07%。BDNF组、NT-3组hBMSCs细胞的BDNF mRNA的相对表达水平均高于hBMSCs组(P值均<0.01),融合基因组hBMSCs细胞的BDNF、NT-3 mRNA的相对表达水平均分别高于hBMSCs组、空载慢病毒组、BDNF组和NT-3组(P值均<0.01);BDNF组、NT-3组、融合基因组hBMSCs细胞的NT-3蛋白相对表达水平均分别高于hBMSCs组和空载慢病毒组(P值均<0.01)。结论成功构建的BDNF、NT-3、BDNF-T2A-NT-3慢病毒载体可介导BDNF和NT-3在hBMSCs中稳定表达,为探索BDNF和NT-3基因在神经退行性疾病发病机制中的作用提供依据。

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来源
《中国职业医学》 |2021年第6期|640-647|共8页
作者
蔡瑜; 彭聪; 陈瑶; 袁瑞; 闫永建;
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作者单位

山东省职业卫生与职业病防治研究院;

山东第一医科大学(山东省医学科学院);

山东济南250062;

山东省泰安市岱岳区卫生健康局;

山东泰安217028;

青岛大学公共卫生学院;

山东青岛266071;

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原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类卫生毒理;
关键词
hBMSCs; 脑源性神经营养因子; 神经营养因子-3; 融合基因; 感染; 构建; 慢病毒载体;

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