磷酸酶张力蛋白同系物基因shRNA重组腺病毒的构建及鉴定

付世新; 邓清华; 韩盈盈; 杨文涛; 李小兵; 王哲

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目的构建携带磷酸酶张力蛋白同系物(phosphoatase and tensin homolog,PTEN)基因的sh RNA重组腺病毒,并探讨其对犊牛肝细胞中PTEN基因m RNA表达水平的影响。方法在Lipofectamine 2000介导下,将4个PTEN基因的psh RNA转染原代犊牛肝细胞,筛选转染效果最佳的psh RNA,将其克隆至重组穿梭载体p Shuttle-EGFP-CMV中,构建重组穿梭质粒p Shuttle-GFP-PTEN-sh RNA,将构建正确的重组穿梭质粒及重组腺病毒骨架载体p Adxsi进行酶切并连接,构建重组腺病毒质粒p Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA。将重组腺病毒质粒经Pac I酶切线性化后,转染人肾K293细胞,包装重组腺病毒Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA,经3轮扩增,测定病毒滴度。荧光定量PCR法检测重组腺病毒对犊牛肝细胞中PTEN基因m RNA表达水平的影响。结果与空白对照组比较,psh RNA1和psh RNA3组中PTEN基因m RNA表达量分别下降了44%和68%(P<0.05,确定p GPU6/GFP/Neo-PTEN-sh RNA3为最佳转染质粒);重组腺病毒质粒p Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA经酶切鉴定证明构建正确,经包装和3轮扩增,重组腺病毒AdxsiGFP-PTEN-sh RNA的滴度为1.2×1010 PFU/ml;转染Adxsi-GFP-PTEN-sh RNA 48 h后,犊牛肝细胞中PTEN表达量为空白对照组和阴性对照组的42%和51%(P<0.05)。结论成功构建了PTEN基因sh RNA重组腺病毒AdxsiGFP-PTEN-sh RNA,有效降低了犊牛肝细胞中PTEN的表达水平,为进一步探讨采用基因疗法防治奶牛脂肪肝奠定了基础。

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来源
《中国生物制品学杂志》 |2015年第3期|271-275|共5页
作者
付世新; 邓清华; 韩盈盈; 杨文涛; 李小兵; 王哲;
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作者单位

黑龙江八一农垦大学动物科技学院;

黑龙江大庆163319;

吉林大学动物医学学院;

吉林长春130062;

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原文格式 PDF
正文语种 chi
中图分类基因载体;基因工程的应用;
关键词
磷酸酶张力蛋白同系物基因; RNA干扰; 腺病毒; 脂肪肝;

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