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双峰驼β-NGF基因的克隆及在生殖轴系的表达

         
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选取健康的雌性双峰驼(5~6岁)的下丘脑、垂体、卵巢、子宫角和输卵管等组织,通过RT-PCR扩增CDS全序列,并进行生物信息学分析;通过qRT-PCR,免疫组织化学染色技术(immunohistochemistry,IHC)和蛋白免疫印记(Western blot)技术检测β-神经生长因子(β-nerve growth factor,β-NGF)在各组织的表达。结果显示,双峰驼β-NGF基因的CDS区(783 bp)可编码261个氨基酸残基,分子式为C_(1219)H_(1914)N_(402)O_(365)S_(11),编码的原子个数为3911,相对分子质量为28.39374 kDa,理论等电点为9.57,β-NGF编码的为非跨膜可溶性蛋白,其二级结构由α-螺旋、延伸链和无规则卷曲构成,该蛋白有22个丝氨酸磷酸化位点,11个苏氨酸磷酸化位点,2个酪氨酸磷酸化位点;同源性分析显示,双峰驼β-NGF的核苷酸序列与单峰驼、羊驼、野猪、山羊、马、黄牛、人、犬、家鼠及家兔的同源性分别为99.6%,99.0%,92.8%,92.6%,91.7%,91.0%,89.5%,89.1%,84.4%,83.7%;IHC结果显示,β-NGF在双峰驼的下丘脑细胞、垂体嗜色细胞和嫌色细胞、卵巢粒细胞、膜细胞和间质细胞、子宫内膜腺上皮细胞和输卵管黏膜上皮细胞均有阳性反应;qRT-PCR结果显示,β-NGF在子宫角中表达量最高,且极显著高于其他组织(P<0.01);Western blot结果显示,β-NGF蛋白在子宫角中表达量最高,且极显著高于下丘脑和输卵管(P<0.01),显著高于垂体(P<0.05)。结果表明,本试验成功克隆出双峰驼β-NGF基因的CDS区,其保守性较高,且该蛋白二级结构有3种折叠方式;β-NGF在子宫角表达水平较高,提示β-NGF可能通过子宫内膜参与了双峰驼的诱导排卵过程。

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