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基于三代测序技术的RHD、RHCE基因mRNA研究

         
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目的建立基于Nanopore的RH基因mRNA三代测序方法,探讨D阳性和D^(el)表型中RHD、RHCE基因mRNA转录本的种类和表达水平差异。方法选取2021年3月~2022年5月成都市各医院送检至本实验室的经RhD血清学初筛及确证试验阴性的RhD阳性标本5例、D^(el)型标本5例。分离有核红细胞和白膜层,提取DNA和RNA,采用PCR-SSP对RhD阳性、D^(el)型基因分型,mRNA逆转录为cDNA后,采用1对引物同时对RHD、RHCE基因的全长mRNA扩增。分别采用Sanger测序和基于纳米孔的三代测序技术对扩增产物进行测序,并对RHD、RHCE基因mRNA转录本的不同剪接体种类和表达量进行分析。结果本研究建立的方法可同时扩增出RHD和RHCE的全长转录本,在10例标本中检测到了10种不同RHD基因mRNA转录本、9种RHCE基因mRNA转录本。D^(el)型中可检测到RHD的全长转录本(RHD-201),但表达量显著低于RhD阳性标本,D^(el)标本中转录本RHD-207(D^(el)789)表达量显著高于RhD阳性标本,转录本RHD-208(D^(el)8910+213)仅在D^(el)型个体中检出,其他RHD转录本以及所有RHCE转录本在2种个体中未发现显著差异。结论本研究成功建立了RHD、RHCE基因mRNA三代测序全长转录本异构体的分析方法,发现RHD、RHCE基因存在复杂的选择性剪接模式,为血型基因变异体mRNA选择性剪接研究提供了新方法。

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