HCV聚合酶在大肠杆菌中表达产物的纯化及结构研究

杨振; 蒋建东; 祁自柏; 陈鸿珊; 张华远; 李河民

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HCV聚合酶在大肠杆菌中表达产物的纯化及结构研究

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目的　构建HCV聚合酶基因重组原核表达质粒 ,研究高效表达聚合酶蛋白的最适条件、表达产物的纯化方法以及最佳变性和复性条件 ,同时分析其二级结构 ,为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物创造条件。方法　采用高保真PfuDNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增 ,从我国HCVRNA阳性病人血清中扩增出HCVNS5bRNA聚合酶全长基因序列 ,构建原核表达载体。在多个载体中选取pET 30a作为表达载体 ,选择诱导表达条件。利用Ni2 + 金属离子螯和亲和层析将其纯化。同时对该酶蛋白的变性和复性条件进行研究 ,对其相关的分子生物学参数和二级结构进行分析。结果　测序及读码框架分析结果表明 ,按照上述技术路线得到了相关HCVNS5bRNA聚合酶全基因序列。在最佳表达条件下 ,诱导表达融合蛋白 (相对分子质量 6 5 0 0 0 ) ,其最高表达量为18 9% ,纯度大于 92 83% ,Westernblot法检测 ,能与HCVNS5b单抗反应 ,证明其为NS5b蛋白。对其二级结构的分析表明 ,已获得了活性基团完整的HCV聚合酶。结论　HCV聚合酶的高效表达和纯化 ,为建立细胞外HCV聚合酶复制模型及筛选药物奠定基础。

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来源
《中国生物制品学杂志》 |2004年第6期|337-340|共4页
作者
杨振; 蒋建东; 祁自柏; 陈鸿珊; 张华远; 李河民;
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作者单位

中国药品生物制品检定所;

中国医学科学院医药生物技术所;

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正文语种 chi
中图分类酶;基因工程（遗传工程）;
关键词
丙型肝炎病毒; 聚合酶; 融合蛋白; 原核表达; 大肠杆菌;

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