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负载microRNA-27b-骨髓间充质干细胞来源外泌体的软骨细胞-聚乳酸羟基乙酸共聚物骨软骨复合体移植治疗软骨缺损的实验研究

         
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目的:探讨负载microRNA-27b(miR-27b)-骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)来源外泌体(exosomes,exo)的软骨细胞(chondrocytes,chon)-聚乳酸羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA]骨软骨复合体移植治疗软骨缺损的效果及作用机制。方法:(1)培养BMSC并制备BMSC来源exo(BMSC-exo),观察BMSC-exo的形态,测定BMSC-exo的粒径和Zeta电位,并采用蛋白质印迹法(Western Blot)检测BMSC-exo表面标记蛋白CD9和CD63。(2)将培养至第2或第3代的BMSC分为2组,BMSC组于RPMI-1640培养基中培养,不进行干预,miR-27b-BMSC组采用miR-27b过表达的重组腺病毒感染;培养24 h后,制备BMSC-exo和miRNA-27b-BMSC-exo,并分别提取BMSC、BMSC-exo、miRNA-27b-BMSC、miRNA-27b-BMSC-exo的RNA,采用实时定量PCR检测miR-27b的表达。(3)分别采用Dil细胞膜红色荧光探针和Hoechst33258染色试剂给miR-27b-BMSC-exo和大鼠软骨细胞染色,于荧光显微镜下观察大鼠软骨细胞对miR-27b-BMSC-exo的摄取情况。(4)将大鼠软骨细胞分为2组,BMSC-exo组接种于BMSC-exo终浓度为80μg·mL^-1的RPMI-1640培养基中,miR-27b-BMSC-exo组接种于miR-27b-BMSC-exo终浓度为80μg·mL^-1的RPMI-1640培养基中;培养4 h后,采用实时定量PCR检测miR-27b的表达。(5)将大鼠软骨细胞分为4组,对照组于RPMI-1640培养基中培养,不进行干预,白细胞介素(interleukin,IL)-1β组在IL-1β终浓度为10 ng·mL^-1的RPMI-1640培养基中培养,miR-27b-BMSC-exo组在IL-1β终浓度为10 ng·mL^-1、miR-27b-BMSC-exo终浓度为80μg·mL^-1的RPMI-1640培养基中培养,BMSC-exo组在IL-1β终浓度为10 ng·mL^-1、BMSC-exo终浓度为80μg·mL^-1的RPMI-1640培养基中培养;分别于培养0 h、1 h、2 h、3 h、4 h和8 h,采用MTT法测定各组大鼠软骨细胞活力;培养24 h后,提取各组大鼠软骨细胞总蛋白,采用Western Blot检测软骨损伤相关蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease,caspase)-3、caspase-9、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-13的表达。(6)取18只8周龄SD雌性大鼠,于SD大鼠的左后肢股骨远端滑车沟槽制造直径4.5 mm、深度1 mm的软骨缺损,建立软骨缺损SD大鼠模型;将18只软骨缺损SD大鼠模型随机分为3组,对照组植入chon-PLGA骨软骨复合体,miR-27b-BMSC-exo组植入miR-27b-BMSC-exo-chon-PLGA骨软骨复合体,BMSC-exo组植入BMSC-exo-chon-PLGA骨软骨复合体;饲养12周后处死SD大鼠,观察软骨修复效果,免疫组织化学染色检测软骨损伤修复标志蛋白Ⅱ型胶原蛋白、MMP-13的表达;提取SD大鼠软骨组织总蛋白,采用Western Blot检测软骨损伤相关蛋白caspase-3、caspase-9、MMP-13的表达。结果:(1)BMSC-exo的鉴定结果。BMSC-exo为圆盘形囊泡状膜结构,粒径92~115 nm,数量占比最高的BMSC-exo的粒径为106 nm;BMSC-exo的Zeta电位为(-22.13±2.1)mV。BMSC-exo表面标记物CD9和CD63在BMSC-exo组的表达量显著高于BMSC组(相对灰度值:6.513±0.714,1.001±0.021,t=18.902,P=0.000;7.564±0.636,1.026±0.027,t=25.158,P=0.000)。(2)miR-27b表达的检测结果。miR-27b在miR-27b-BMSC组BMSC中的表达量高于BMSC组(相对表达量:46.785±8.153,1.000±0.280,t=13.748,P=0.000);miR-27b在miR-27b-BMSC组exo中的表达量高于BMSC组(相对表达量:34.825±8.612,1.000±0.325,t=9.621,P=0.000)。(3)miR-27b-BMSC-exo的摄取情况。大鼠软骨细胞和miR-27b-BMSC-exo共培养4 h,miR-27b-BMSC-exo被大鼠软骨细胞摄取。(4)共培养后大鼠软骨细胞中miR-27b表达的检测结果。miR-27b在miR-27b-BMSC-exo组大鼠软骨细胞中的表达量高于BMSC-exo组(相对表达量:3.315±0.523,1.000±0.244,t=9.826,P=0.000)。(5)大鼠软骨细胞活力测定结果。时间因素与分组因素存在交互效应(F=2.836,P=0.049)。4组大鼠软骨细胞活力总体比较,差异有统计学意义,即存在分组效应(F=11.345,P=0.049)。培养前及培养1 h、2 h,大鼠软骨细胞活力的组间差异无统计学意义(F=0.047,P=0.406;F=0.765,P=0.189;F=2.095,P=0.063);培养3 h、4 h、8 h,大鼠软骨细胞活力的组间差异有统计学意义(F=4.720,P=0.039;F=7.421,P=0.021;F=95.348,P=0.000),IL-1β组的大鼠软骨细胞活力小于对照组、miR-27b-BMSC-exo组、BMSC-exo组(3 h:P=0.002,P=0.011,P=0.026;4 h:P=0.002,P=0.002,P=0.006;8 h:P=0.004,P=0.004,P=0.011),miR-27b-BMSC-exo组的大鼠软骨细胞活力大于对照组和BMSC-exo组(3 h:P=0.019,P=0.023;4 h:P=0.015,P=0.002;8 h:P=0.003,P=0.029)。不同时间点大鼠软骨细胞活力总体比较,差异无统计学意义,即不存在时间效应(F=0.258,P=0.083)。(6)大鼠软骨细胞中软骨损伤相关蛋白表达的检测结果。切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13的表达量组间比较,差异有统计学意义(F=15.691,P=0.024;F=98.021,P=0.002;F=76.312,P=0.004),IL-1β组大鼠软骨细胞中切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13的表达量均高于对照组、miR-27b-BMSC-exo组、BMSC-exo组(切割-caspase-3:P=0.025,P=0.020,P=0.006;切割-caspase-9:P=0.011,P=0.008,P=0.036;MMP-13:P=0.034,P=0.003,P=0.009);miR-27b-BMSC-exo组大鼠软骨细胞中切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13的表达量均低于BMSC-exo组(P=0.023,P=0.010,P=0.007)。(7)SD大鼠软骨缺损修复效果。直视下观察,miR-27b-BMSC-exo组SD大鼠软骨缺损修复效果优于对照组和BMSC-exo组。病理染色结果显示,对照组软骨层较薄,边缘不规则,软骨下骨和软骨无界限;miR-27b-BMSC-exo组和BMSC-exo组软骨层较厚,边缘光滑,软骨下骨和软骨界限清晰,且miR-27b-BMSC-exo组透明软骨修复效果优于BMSC-exo组。(8)软骨损伤修复标志蛋白表达的检测结果。免疫组织化学染色显示,对照组和BMSC-exo组SD大鼠软骨组织中MMP-13高表达,miR-27b-BMSC-exo组SD大鼠软骨组织中MMP-13低表达;对照组SD大鼠软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白低表达,BMSC-exo组和miR-27b-BMSC-exo组SD大鼠软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白高表达。MMP-13、Ⅱ型胶原蛋白表达阳性率的组间比较,差异有统计学意义(F=126.178,P=0.002;F=209.24,P=0.001)。miR-27b-BMSC-exo组SD大鼠软骨组织中Ⅱ型胶原蛋白表达量高于对照组和BMSC-exo组(P=0.005,P=0.012),MMP-13的表达量低于对照组和BMSC-exo组(P=0.029,P=0.014)。(9)SD大鼠软骨组织中软骨损伤相关蛋白表达的检测结果。切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13表达量的组间比较,差异有统计学意义(F=15.126,P=0.026;F=33.151,P=0.019;F=53.522,P=0.016),miR-27b-BMSC-exo组切割-caspase-3、切割-caspase-9和MMP-13的表达量均低于对照组和BMSC-exo组(切割-caspase-3:P=0.003,P=0.006;切割-caspase-9:P=0.001,P=0.019;MMP-13:P=0.007,P=0.008)。结论:miR-27b-BMSC-exo-chon-PLGA骨软骨复合体移植治疗软骨缺损,治疗效果显著,其作用机制可能与抑制caspase-3、caspase-9以及MMP-13的表达、促进Ⅱ型胶原蛋白的表达有关。

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