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异莲心碱促进Nrf2/HO-1通路减轻缺氧/复氧致心肌细胞凋亡的机制研究

         
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目的探究异莲心碱(Isoliensinine,IL)对心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia/reperfusion injury,MI/RI)的作用及其机制。方法提取新生大鼠原代心肌细胞并鉴定,在离体状态下建立心肌细胞缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模型,CCK-8法检测不同浓度异莲心碱对H/R处理后细胞活力的影响并确定最佳药物浓度。随后,将心肌细胞随机分为对照组、H/R组及H/R+IL组,每组6只。检测3组乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)的水平评估细胞损伤,TUNEL染色观察心肌细胞凋亡情况。RT-PCR及蛋白免疫印迹法检测活化半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、核因子E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶-1(HO-1)的mRNA和蛋白表达情况。结果荧光显微镜下观察原代细胞,α-actinin染色阳性为心肌细胞(红色),其纯度高。异莲心碱处理6、12 h时,相对于H/R组,1μg/ml和5μg/ml异莲心碱均能明显升高细胞活性,且5μg/ml效果更为显著(P<0.05),而在作用24 h时,两种浓度效果无明显差异。此外,10μg/ml异莲心碱会导致细胞活力下降,综合考虑实验时长因素,选用5μg/ml为最佳作用浓度用于后续实验。与CON组比较,H/R组培养基中LDH和CK-MB释放量显著升高(P<0.05);与H/R组比较,H/R+IL组LDH和CK-MB释放量显著降低(P<0.05)。经过H/R处理后,心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.001),TUNEL染色阳性的细胞数目明显增加。而异莲心碱能减轻H/R诱导的细胞凋亡,与H/R组相比,H/R+IL组TUNEL染色阳性的细胞比例明显减少(P<0.01)。与CON组比较,H/R组心肌细胞Bax及Caspase-3的mRNA表达量和蛋白表达水平显著升高(P<0.001),Bcl-2的mRNA和蛋白表达明显降低(P<0.01),Bcl-2/Bax值下降;与H/R组比较,H/R+IL组心肌细胞Bax及Caspase-3的mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.05),Bcl-2表达显著增高(P<0.05),Bcl-2/Bax值升高。与CON组比较,H/R组心肌细胞Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表达量显著下降(P<0.01);与H/R组比较,H/R+IL组心肌细胞的Nrf2和HO-1的mRNA和蛋白表达明显升高(P<0.05)。结论异莲心碱可能通过促进Nrf2/HO-1通路来抑制H/R引起的心肌细胞凋亡。

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