目的:利用同源重组和反向PCR扩增技术构建溴区包含蛋白7(bromodomain-containing protein 7,BRD7)的溴区结构域(bromodomain)缺失的真核表达载体.方法:设计一对反向PCR引物,以预先构建好的pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7质粒为模板,利用高保真酶的高保真性和较长的延伸能力,反向扩增出BRD7溴区结构域缺失突变体(pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd)的线性DNA片段,然后转化大肠杆菌,利用大肠杆菌同源重组修复能力即可自身环化,而不需要经连接酶连接或其他处理即可得到pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd重组表达质粒,通过测序和Western印迹进一步对该缺失突变体的序列和蛋白质表达性能进行验证.结果:通过酶切鉴定、测序和Western印迹证实pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd构建成功.结论:利用PCR反向扩增和同源重组技术,可以简便快速地构建pIRES2-EGFP-3Flag/BRD7△brd突变体,实验成本较低,并且发现质粒模板浓度会影响载体的同源重组效率,这种改进的技术可广泛应用到基因突变体的构建.
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