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基于CRISPR/Cas9技术构建AMPKα1敲除的3T3-L1细胞系

         
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目的利用CRISPR/Cas9系统构建腺苷酸激活蛋白激酶α1(adenosine 5′-monophosphate-activated protein kinaseα1,AMPKα1)基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞3T3-L1细胞系,为研究AMPKα1在脂肪细胞中的生物学功能提供细胞模型。方法在NCBI上查找AMPKα1基因序列,利用张锋实验室网站设计sg RNA。利用lenti CRISPR质粒构建AMPKα1敲除质粒,构建好的质粒与辅助质粒共同转染293T细胞获得慢病毒。用病毒液感染目的细胞3T3-L1,嘌呤霉素筛选感染成功的细胞。将3T3-L1细胞诱导成成熟的脂肪细胞,与RAW264.7细胞共培养48h,检测RAW264.7细胞中核转录因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)表达情况。结果蛋白质印迹(Western blot,WB)法与Q-PCR法检测结果表明获得稳定敲除AMPKα1的3T3-L1细胞(P<0.01);与RAW264.7细胞共培养WB法检测RAW264.7细胞中NF-κB。结果表明,AMPKα1敲除的成熟脂肪细胞分泌因子增加巨噬细胞RAW264.7细胞中的NF-κB蛋白表达。结论本研究利用成簇的规律间隔的短回文重复序列/Cas9核酸酶(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9,CRISPR/Cas9)系统成功构建了AMPKα1敲除的细胞系,为后续深入研究AMPKα1基因在3T3-L1细胞系中的作用及其机制奠定了一定的基础。

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