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首页> 中文期刊> 《南方医科大学学报》 >pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化

pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒的构建及PEP-1-CAT融合蛋白的表达与纯化

         
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目的 构建pET15b-PEP-1-CAT原核表达质粒,并表达、纯化得到融合蛋白PEP-1-CAT,为防治与氧化应激有关的疾病奠定基础.方法 设计并合成两端分别带Sal Ⅰ和Bgl Ⅱ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA.将扩增的CAT cDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3'末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中得到pGEM-T-CAT.人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1.pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经Sal Ⅰ-Bgl Ⅱ和Xho Ⅰ-BamH I双酶切,利用同尾酶(Sal Ⅰ与Xho Ⅰ,Bgl Ⅱ与BamH I)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实.将鉴定正确的pET15b-PEP-1-CAT重组质粒转化BL21(DE3),用IPTG诱导目的蛋白表达.然后利用重组蛋白N端的组氨酸"标签"(His-tag)对其进行金属螯合亲和层析纯化.结果 测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为"AY028632"的CAT cDNA序列一致.SDS-PAGE和Western blot结果表明,pET15b-PEP-1-CAT在E.coli中获得可溶性高表达,经Ni2+-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了PAGE纯的融合蛋白PEP-1-CAT,并在体外检测到其具有特异的过氧化氢酶活性,活性值为77.15 U/g.结论 成功构建了原核表达载体pET15b-PEP-1-CAT,并经表达、纯化得到可以天然活性形式穿透细胞的重组过氧化氢酶蛋白,从而为防治心肌缺血再灌注损伤等与氧化应激有关的疾病奠定了基础.

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