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赭曲霉甾体11α-羟化酶基因AOH在毕赤酵母中的表达及功能分析

         
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摘要

11α-羟基左旋乙基甾烯双酮(11α-OH-GD)是生产高效避孕药去氧孕烯的关键中间体.丝状真菌赭曲霉(Aspergillus ochraceus)TCCC41060可以转化左旋乙基甾烯双酮(GD)形成11α-OH-GD,但该转化反应特异性低,副产物偏高,限制了其工业应用.为了研究赭曲霉转化GD特异性偏低的机理,本文克隆了赭曲霉11α-羟化酶基因AOH并构建了表达载体pPIC3.5,K-AOH,获得了重组毕赤酵母菌株.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)与免疫印迹实验(Western blot)分析表明,AOH重组蛋白相对分子质量为6.12×104,与预测结果一致.对转化产物进行薄层色谱(TLC)和高效液相色谱(HPLC)分析结果显示,AOH重组菌株能够转化GD,形成目标产物11α-OH-GD以及3种副产物.以上结果表明:AOH基因编码的甾体11α-羟化酶对底物GD转化反应的特异性较差.%11α-hydroxy-13-ethyl-gon-4-en-3,17-dione(11α-OH-GD)is a key intermediate in the synthesis of desogestrel,a major ingredient of the third generation of oral contraceptive.Filamentous fungusAspergillus ochraceusTCCC41060 can convert 13-ethyl-gon-4-en-3,17-dione(GD)into 11α-OH-GD.However,low reaction specificity and high-level side prod-ucts limit its application in large-scale preparation of 11α-hydroxy-GD.In order to investigate the mechanism of low reaction specificity ofA.ochraceus TCCC41060 on substrate GD,cDNA of 11α-hydroxylase geneAOH was cloned and ligated to plasmid pPIC3.5,K in order to generate expression vector pPIC3.5,K-AOH;and then recombinantP.pastoris strains express-ing AOH were constructed.SDS-PAGE and Western blot analyses indicated that AOH was 6.12×104,which was consistent with the predicted size.TLC and HPLC analyses showed that the AOH recombinantP.pichia strain was capable of trans-forming GD into the target product 11α-OH-GD and three types of side products.The results indicated that the 11α-hydroxylase withAOH gene has poor specificity of conversion reaction on GD.

著录项

  • 来源
    《天津科技大学学报》 |2017年第5期|34-3878|共6页
  • 作者

    郭凯; 曹通; 黄琳琳; 刘晓光; 王正祥; 路福平;

  • 作者单位

    工业发酵微生物教育部重点实验室,工业酶国家工程实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津 300457;

    工业发酵微生物教育部重点实验室,工业酶国家工程实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津 300457;

    工业发酵微生物教育部重点实验室,工业酶国家工程实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津 300457;

    工业发酵微生物教育部重点实验室,工业酶国家工程实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津 300457;

    工业发酵微生物教育部重点实验室,工业酶国家工程实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津 300457;

    工业发酵微生物教育部重点实验室,工业酶国家工程实验室,天津市工业微生物重点实验室,天津科技大学生物工程学院,天津 300457;

  • 原文格式 PDF
  • 正文语种 chi
  • 中图分类 基因的表达;
  • 关键词

    赭曲霉; 11α-左旋乙基甾烯双酮; 毕赤酵母;

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