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代谢工程改造大肠杆菌合成丁二酸及发酵罐放大工艺

         
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[背景]Escherichia coli AFP111发酵生产丁二酸时大量副产乙酸,丁二酸得率低.[目的]代谢工程改造Escherichia coli AFP111,提高丁二酸得率,降低副产物乙酸的生成,建立100 L规模的丁二酸发酵工艺.[方法]一步同源重组敲除乙酸合成途径关键酶基因,改造丁二酸合成途径关键酶启动子实现过表达;单因素优化5L发酵罐培养条件.[结果]敲除乙酸产生途径编码乙酸激酶和磷酸转乙酰酶的基因ackA-pta,苏氨酸脱羧酶和2-酮丁酸甲酸裂解酶的基因tdcDE获得SX02菌株,摇瓶发酵条件下其乙酸产量下降了53.42％,丁二酸得率提高9.85％.在SX02菌株基础上,经启动子改造过表达编码葡萄糖激酶的基因glk后获得菌株SX03,其Glk酶活性提高3.66倍,乙酸产量下降了31.62％,丁二酸得率提高8.28％.SX03菌株发酵生产丁二酸在5L发酵罐进行放大,其乙酸产量为3.97 g/L,丁二酸得率为1.62 mol/mol葡萄糖,相比出发菌株的乙酸产量下降了75.76％,丁二酸得率提高19.12％.在5L发酵罐上对比研究了中和剂Na2CO3和NaOH混合液替换碱式MgCO3的发酵效果,并优化了发酵pH、搅拌转速和葡萄糖浓度,获得如下最适发酵条件:pH 6.8,搅拌转速250 r/min,葡萄糖100 g/L,发酵结束时乙酸产量为2.24 g/L,丁二酸得率为1.66 mol/mol葡萄糖.中和剂替换优化后乙酸产量下降了20.65％,丁二酸得率提高2.47％.菌株SX03发酵工艺进一步在100 L发酵罐上实现放大,其乙酸产量为1.91 g/L,丁二酸得率为1.30 mol/mol葡萄糖.[结论]通过代谢工程改造的大肠杆菌,其副产物乙酸含量显著下降,丁二酸得率提高,并在5L和100 L发酵罐上实现了工艺放大,展现出较大的工业化利用潜力.

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