6-羟基烟酸3-单加氧酶NicC的纯化与结晶

郭丽华; 唐鸿志; 吴更

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6-羟基烟酸3-单加氧酶NicC的纯化与结晶

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[背景]含氮杂环吡啶化合物是重要的环境污染物之一,在人体内长期积累会导致肿瘤/畸胎等疾病,利用微生物降解含氮杂环化合物是一种非常有效的途径.[目的]在大肠杆菌中克隆表达6-羟基烟酸3-单加氧酶基因nicC,纯化重组NicC蛋白并进行结晶条件的研究.[方法]以恶臭假单胞菌KT2440为模板对nicC基因进行PCR扩增,构建重组表达载体pET28a-nicC,在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)中诱导表达,利用亲和层析和凝胶过滤层析纯化重组蛋白.利用悬滴扩散法对NicC蛋白进行结晶条件筛选和优化.[结果]成功构建重组质粒pET28a-nicC并纯化获得达到结晶纯度的NicC蛋白.通过结晶条件初筛和正交优化实验发现,NicC蛋白的最佳结晶条件为:0.2 mol/L NH4Cl,0.01 mol/L CaCl2·2H2O,31％ PEG4000,0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.0,4℃;SeMet-NicC蛋白和NicC与6-HNA共晶的最佳结晶条件为:0.2 mol/L NHaCl,0.01 mol/L CaCl2·2H2O,0.05 mol/L Tris-HCl pH 7.9,31％ PEG3350,4℃.[结论]NicC蛋白纯化体系的构建和结晶条件的研究为最终解析NicC蛋白三维结构提供了有利条件,为揭示吡啶环β位单加氧酶识别含吡啶环底物并催化底物的吡啶环上β位羟基化的分子机理奠定了基础.

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来源
《微生物学通报》 |2020年第7期|2021-2027|共7页
作者
郭丽华; 唐鸿志; 吴更;
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作者单位

上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海 200240;

上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海 200240;

上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室上海 200240;

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正文语种 chi
中图分类
关键词
NicC蛋白; 重组表达; 蛋白纯化; 结晶初筛; 晶体优化;

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