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首页> 美国卫生研究院文献>Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America >Open reading frame expression vectors: a general method for antigen production in Escherichia coli using protein fusions to beta-galactosidase.
【2h】

Open reading frame expression vectors: a general method for antigen production in Escherichia coli using protein fusions to beta-galactosidase.

机译：开放阅读框表达载体：使用与β-半乳糖苷酶融合的蛋白质在大肠杆菌中生产抗原的一般方法。

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摘要

We have developed an Escherichia coli plasmid vector for the identification and expression of foreign DNA segments that are open reading frames (ORFs). The 5' end of ompF, an E. coli gene encoding an abundant outer membrane protein, is used to provide a strong, regulated promoter, translation initiation site, and signal sequence for export from the cytoplasm. This sequence is coupled to the lacZ gene of E. coli so that expression of beta-galactosidase requires ompF transcription and translation signals. However, this hybrid gene is LacZ- because lacZ is out of frame with respect to ompF. Restriction enzyme recognition sites are located between ompF and lacZ to allow convenient insertion of DNA fragments. If an insert is an ORF of the correct length, ompF and lacZ become realigned in frame, resulting in a LacZ+ gene that produces a tribrid protein with the translation product of the insert sandwiched between OmpF and beta-galactosidase. The LacZ+ phenotype thus identifies clones containing an expressed ORF. To demonstrate the vector's utility we inserted a fragment from the herpes virus thymidine kinase gene and used the resulting tribrid protein to raise antibodies that precipitate thymidine kinase from herpes virus-infected cells. We also inserted a fragment from the E. coli lexA gene to produce a tribrid protein that is precipitated by antiserum raised with LexA protein. Thus, tribrid fusion proteins can be used to produce or detect antibodies and also to identify the product of a cloned gene.
机译：我们已经开发出一种大肠杆菌质粒载体，用于鉴定和表达开放阅读框（ORF）的外源DNA片段。 ompF的5'端是一种编码大量外膜蛋白的大肠杆菌基因，用于提供强大的，受调控的启动子，翻译起始位点和信号序列，以从细胞质中输出。该序列与大肠杆菌的lacZ基因偶联，因此β-半乳糖苷酶的表达需要ompF转录和翻译信号。但是，该杂种基因是LacZ-，因为lacZ相对于ompF是不合框架的。限制酶识别位点位于ompF和lacZ之间，可方便地插入DNA片段。如果插入片段是正确长度的ORF，则ompF和lacZ会在框架中重新排列，从而产生一个LacZ +基因，该基因会产生三股蛋白，插入片段的翻译产物夹在OmpF和β-半乳糖苷酶之间。因此，LacZ +表型鉴定了含有表达的ORF的克隆。为了证明该载体的实用性，我们从疱疹病毒胸苷激酶基因中插入了一个片段，并使用所得的三杂交蛋白产生了抗体，这些抗体从感染疱疹病毒的细胞中沉淀出胸苷激酶。我们还从大肠杆菌lexA基因中插入了一个片段，以产生三叉蛋白，该蛋白由LexA蛋白产生的抗血清沉淀。因此，三杂交融合蛋白可用于产生或检测抗体，也可用于鉴定克隆基因的产物。

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