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【2h】

Deciphering the Interplay among Multisite PhosphorylationInteraction Dynamics and Conformational Transitions in a TripartiteProtein System

机译：解读多位磷酸化之间的相互作用三方性中的相互作用动力学和构象转变蛋白质系统

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Multisite phosphorylation is a common pathway to regulate protein function, activity, and interaction pattern in vivo, but routine biochemical analysis is often insufficient to identify the number and order of individual phosphorylation reactions and their mechanistic impact on the protein behavior. Here, we integrate complementary mass spectrometry (MS)-based approaches to characterize a multisite phosphorylation-regulated protein system comprising Polo-like kinase 1 (Plk1) and its coactivators Aurora kinase A (Aur-A) and Bora, the interplay of which is essential for mitotic entry after DNA damage-induced cell cycle arrest. Native MS and cross-linking–MS revealed that Aur-A/Bora-mediated Plk1 activation is accompanied by the formation of Aur-A/Bora and Plk1/Bora heterodimers. We found that the Aur-A/Bora interaction is independent of the Bora phosphorylation state, whereas the Plk1/Bora interaction is dependent on extensive Bora multisite phosphorylation. Bottom-up and top-down proteomics analyses showed that Bora multisite phosphorylation proceeds via a well-ordered sequence of site-specific phosphorylation reactions, whereby we could revealthe involvement of up to 16 phosphorylated Bora residues. Ion mobilityspectrometry–MS demonstrated that this multisite phosphorylationprimes a substantial structural rearrangement of Bora, explainingthe interdependence between extensive Bora multisite phosphorylationand Plk1/Bora complex formation. These results represent a first benchmarkof our multipronged MS strategy, highlighting its potential to elucidatethe mechanistic and structural implications of multisite protein phosphorylation.
机译：多位点磷酸化是调节体内蛋白质功能，活性和相互作用方式的常见途径，但是常规的生化分析通常不足以鉴定单个磷酸化反应的数量和顺序及其对蛋白质行为的机理影响。在这里，我们整合了基于质谱的互补方法，以表征包含Polo样激酶1（Plk1）及其共激活因子Aurora激酶A（Aur-A）和Bora的多位点磷酸化调节的蛋白质系统，其相互作用是DNA损伤诱导的细胞周期停滞后，有丝分裂进入必不可少。天然质谱和交联质谱表明Aur-A / Bora介导的Plk1活化伴随着Aur-A / Bora和Plk1 / Bora异二聚体的形成。我们发现，Aur-A / Bora相互作用独立于Bora磷酸化状态，而Plk1 / Bora相互作用则依赖于广泛的Bora多位点磷酸化。自下而上和自上而下的蛋白质组学分析表明，Bora多位点磷酸化通过位点特异性磷酸化反应的有序序列进行，由此我们可以揭示涉及多达16个磷酸化的Bora残基。离子迁移率质谱分析表明该多位点磷酸化引发了Bora的实质性结构重组，解释Bora多位点磷酸化之间的相互依赖性和Plk1 / Bora复合物的形成。这些结果代表了第一个基准多管齐下的MS战略，突出了其阐明潜力多位点蛋白质磷酸化的机制和结构意义。

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