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首页> 外文期刊>Revista Cubana de Hematología, Inmunología y Hemoterapia >Optimization of deoxyribonucleic acid extraction for molecular typing of human leukocyte antigens
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Optimization of deoxyribonucleic acid extraction for molecular typing of human leukocyte antigens

机译：用于人白细胞抗原分子分型的脱氧核糖核酸提取的优化

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Para la tipificación de los antígenos leucocitarios humanos (HLA) por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con el método de cebador específico de secuencia (SSP), se necesitan entre 3 y 6 µg de ácido desoxirribonucleico (ADN) de elevada pureza. Se realizó un estudio en el Centro de Ingeniería Celular y Trasplante de Órganos y Tejidos del Instituto de Hematología e Inmunología, para determinar las condiciones y las muestras óptimas para la realización de esta prueba. El ADN se extrajo de muestras de sangre fresca y de sangre total y capa leucocitaria almacenadas en congelación, así como de sangre coagulada y plasma de 15 voluntarios, y de una suspensión de linfocitos. Se utilizó un extractor “QIAcube” y el sistema “QIAamp DNA Blood Mini”. La concentración y pureza del ADN se determinaron mediante un espectrofotómetro de microgotas “EPOCH” con software “Gen 5”. A partir de 200 µL de sangre total y de capa leucocitaria se obtuvieron como promedio 5.8 y 22.4 µg de ADN, respectivamente; sobrepasando siempre los 3 µg. El 100 % de las muestras de plasma y el 6,6 % de sangre coagulada proporcionaron menos de 3 µg. De una suspensión de 30 x 106 linfocitos se obtuvieron 40 µg. La razón A260/A280 estuvo siempre entre 1.7 y 2. La sangre total y la capa leucocitaria, tanto frescas como congeladas, rindieron en todos los casos una cantidad óptima de ADN, no así el plasma y la sangre coagulada. La mayor cantidad de ADN se extrajo de una suspensión de linfocitos. Todos los eluatos tuvieron adecuada pureza independientemente del tipo de muestra. Palabras clave: antígenos HLA, complejo principal de histocompatibilidad, trasplante de órganos, extracción de ADN. ABSTRACT For typing the Human Leukocyte Antigens (HLA) by Polymerase Chain Reaction using the Specific Sequence Primer (SSP) method, between 3 and 6 µg of high pureness Deoxyribonucleic Acid (DNA) are needed. In order to establish the best conditions for DNA extraction, as well as the optimal samples, an investigation was carried out in the Center for Cellular Engineering and Organs and Tissues Transplantations in Havana, Cuba. DNA was extracted from fresh and frozen samples of blood, buffy coat, coagulated blood and plasma from 15 volunteers and also extracted from a lymphocyte suspension. A “QIAcube” extractor anda Kit “QIAamp DNA Blood Mini” were used. The DNA concentration and pureness was measured by an “EPOCH” microdot spectrophotometer running “Gen 5” software. From 200 µL of blood or buffy coat means of 5.8 and 22.4 µg of DNA, respectively, were obtained and in all cases the amount of DNA was over 3 µg. One hundred percent of plasma samples and the 6,6 % of coagulated blood samples yielded less than 3 µg of DNA. Forty µg of DNA were extracted from a cell suspension containing 30 x 106 lymphocytes. The A260/A280 ratio was between 1.7 and 2 in all eluates. The fresh or frozen blood and buffy coat yielded an optimum amount of DNA  in the experiments, but not in plasma nor in coagulated blood. The highest amount of DNA was extracted from a lymphocyte suspension. All eluates were of fine pureness.
机译：使用序列特异性引物（SSP）通过聚合酶链反应（PCR）进行人白细胞抗原（HLA）分型时，需要3至6 µg高纯度脱氧核糖核酸（DNA）。在血液学和免疫学研究所细胞工程与器官和组织移植中心进行了一项研究，以确定进行该试验的最佳条件和样品。从新鲜血液，冷冻保存的全血和血沉棕黄层样本，15名志愿者的凝结的血液和血浆中提取DNA，并从淋巴细胞悬液中提取DNA。使用“ QIAcube”提取器和“ QIAamp DNA Blood Mini”系统。使用带有“ Gen 5”软件的“ EPOCH”微滴分光光度计测定DNA的浓度和纯度。从200 µL的全血和血沉棕黄层中，分别平均得到5.8和22.4 µg的DNA。始终超过3 µg。 100％的血浆样品和6.6％的凝结血样少于3 µg。从30×106淋巴细胞的悬浮液中获得40μg。 A260 / A280的比率始终在1.7和2之间。新鲜和冷冻的全血和血沉棕黄层在所有情况下都能产生最佳的DNA量，而血浆和凝结的血则没有。从淋巴细胞悬液中提取了最大量的DNA。无论样品类型如何，所有洗脱液均具有足够的纯度。关键词：HLA抗原，主要组织相容性复合体，器官移植，DNA提取。摘要要使用特定序列引物（SSP）方法通过聚合酶链式反应对人白细胞抗原（HLA）进行分型，需要3至6 µg高纯度的脱氧核糖核酸（DNA）。为了建立最佳的DNA提取条件和最佳样品，古巴哈瓦那的细胞工程与器官和组织移植中心进行了调查。从15位志愿者的新鲜和冷冻血液，血沉棕黄层，凝血和血浆中提取DNA，并从淋巴细胞悬液中提取DNA。使用“ QIAcube”提取器和试剂盒“ QIAamp DNA Blood Mini”。通过运行“ Gen 5”软件的“ EPOCH”微点分光光度计测量DNA浓度和纯度。从200 µL血液或血沉棕黄层中分别获得5.8和22.4 µg DNA，在所有情况下，DNA量均超过3 µg。 100％的血浆样品和6.6％的凝结血样产生的DNA少于3 µg。从含有30 x 106淋巴细胞的细胞悬液中提取40 µg DNA。在所有洗脱液中，A260 / A280比率在1.7和2之间。新鲜或冷冻的血液和血沉棕黄层在实验中产生了最适量的DNA，但血浆和凝结的血液中却没有。从淋巴细胞悬液中提取出最高量的DNA。所有洗脱液均具有良好的纯度。

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