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Transcription Activation In Vitro by the Bradyrhizobium japonicum Regulatory Protein FixK2

机译：慢生根瘤菌调控蛋白FixK2体外转录激活

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In Bradyrhizobium japonicum, the N2-fixing root nodule endosymbiont of soybean, a group of genes required for microaerobic, anaerobic, or symbiotic growth is controlled by FixK2, a key regulator that is part of the FixLJ-FixK2 cascade. FixK2 belongs to the family of cyclic AMP receptor protein/fumarate and nitrate reductase (CRP/FNR) transcription factors that recognize a palindromic DNA motif (CRP/FNR box) associated with the regulated promoters. Here, we report on a biochemical analysis of FixK2 and its transcription activation activity in vitro. FixK2 was expressed in Escherichia coli and purified as a soluble N-terminally histidine-tagged protein. Gel filtration experiments revealed that increasing the protein concentration shifts the monomer-dimer equilibrium toward the dimer. Purified FixK2 productively interacted with the B. japonicum σ80-RNA polymerase holoenzyme, but not with E. coli σ70-RNA polymerase holoenzyme, to activate transcription from the B. japonicum fixNOQP, fixGHIS, and hemN2 promoters in vitro. Furthermore, FixK2 activated transcription from the E. coli FF(?41.5) model promoter, again only in concert with B. japonicum RNA polymerase. All of these promoters are so-called class II CRP/FNR-type promoters. We showed by specific mutagenesis that the FixK2 box at nucleotide position ?40.5 in the hemN2 promoter, but not that at ?78.5, is crucial for activation both in vivo and in vitro, which argues against recognition of a potential class III promoter. Given the lack of any evidence for the presence of a cofactor in purified FixK2, we surmise that FixK2 alone is sufficient to activate in vitro transcription to at least a basal level. This contrasts with all well-studied CRP/FNR-type proteins, which do require coregulators.
机译：在日本大豆根瘤菌中，固定N 2 根结节的大豆内共生体，FixK 2控制着一组微需氧，厌氧或共生生长所需的基因。 ，它是FixLJ-FixK 2 级联的一部分的关键调节器。 FixK 2 属于环状AMP受体蛋白/富马酸酯和硝酸还原酶（CRP / FNR）转录因子家族，可识别与调控启动子相关的回文DNA图案（CRP / FNR盒）。在这里，我们报告了FixK 2 的生化分析及其在体外的转录激活活性。 FixK 2 在大肠杆菌中表达，并纯化为可溶的N端组氨酸标签蛋白。凝胶过滤实验表明，增加蛋白质浓度会使单体-二聚体平衡向二聚体移动。纯化的FixK 2 与 B有效地相互作用。 japonicum σ 80 -RNA聚合酶全酶，但对 E不适用。大肠杆菌σ 70 -RNA聚合酶全酶，激活 B的转录。 japonicum fixNOQP ， fixGHIS 和 hemN 2 启动子在体外。此外，FixK 2 激活了 E的转录。大肠杆菌FF（？41.5）模型启动子，同样仅与 B协同作用。 japonicum RNA聚合酶。所有这些启动子都是所谓的II类CRP / FNR型启动子。通过特异性诱变，我们发现在 hemN 2 启动子中核苷酸位置？40.5处的FixK 2 框，而不是在？78.5处的FixK 2 框是在体内和体外激活中起关键作用，这反对识别潜在的III类启动子。鉴于在纯化的FixK 2 中缺乏辅助因子存在的任何证据，我们推测，单独的FixK 2 足以将体外转录激活至至少基础水平。这与所有需要深入研究的CRP / FNR型蛋白质形成鲜明对比，后者确实需要调节剂。

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