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【24h】

Allosteric Effect of ATP on Na+,K+-ATPase Conformational Kinetics

机译：ATP对Na +，K + -ATPase构象动力学的变构作用

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The kinetics of the E2 -> E1 conformational change of unphosphorylated Na+,K+-ATPase was investigated via the stopped-flow technique using the fluorescent label RH421 (pH 7.4,24 °C).The enzyme was pre-equilibrated in a solution containing 25 mM histidine and 0.1 mM EDTA to stabilize the E2 conformation.When rabbit enzyme was mixed with 130 mM NaCl alone or with 130 mM NaCl and varying concentrations of Na2ATP simultaneously,a fluorescence decrease was observed.In the absence of ATP,the fluorescence decrease followed a biexponential time course,but at ATP concentrations after mixing of >=50 mu M,the fluorescence transient could be adequately fitted by a single exponential.On the basis of the agreement between theoretical simulations and experimental traces,we propose that in the absence of bound ATP the conformational transition occurs as a two step reversible process within a protein dimer,E2:E2 -> E2:E1 -> E1:E1.In the presence of 130 mM NaCl,the sum of the forward and backward rate constants for the E2:E2 -> E2:E1 and E2:E1 -> E1:E1 transitions were found to be 10.4 (+-1.0) and 0.49 (+-0.02) s~(-1),respectively.At saturating concentrations of ATP,however,the transition occurs in a single reversible step with the sum of its forward and backward rate constants equal to 35.2 (+-0.3) s~(-1).It was found that ATP acting at a high affinity site (K_d approx = 0.25 mu M),stimulated the reverse reaction,E1ATP -> E2ATP,in addition to its known allosteric low affinity (K_d approx = 71 mu M) stimulation of the forward reaction,E2ATP -> E1ATP.
机译：使用荧光标记RH421（pH 7.4,24°C），通过停止流动技术研究了未磷酸化的Na +，K + -ATPase的E2-> E1构象变化的动力学。 mM组氨酸和0.1 mM EDTA稳定E2构象。当兔子酶单独与130 mM NaCl或与130 mM NaCl混合并同时改变浓度的Na2ATP时，观察到荧光减弱。在没有ATP的情况下，荧光降低一个双指数的时间过程，但是在混合浓度大于等于50μM后，在ATP浓度下，荧光瞬变可以由一个指数来拟合。在理论模拟和实验痕迹之间的一致性的基础上，我们建议在没有在二聚体E2：E2-> E2：E1-> E1：E1中，构象转变是两步可逆的过程。在存在130 mM NaCl的情况下，正向和反向速率的总和为在饱和浓度下，E2：E2-> E2：E1和E2：E1-> E1：E1的瞬时变化分别为10.4（+ -1.0）和0.49（+ -0.02）s〜（-1）。然而，ATP发生在一个可逆的步骤中，其前进和后退速率常数之和等于35.2（+ -0.3）s〜（-1）。 K_d大约= 0.25μM），刺激了逆反应，E1ATP-> E2ATP，除了已知的变构低亲和力（K_d大约= 71μM）刺激了正向反应，E2ATP-> E1ATP。

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