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首页> 外文期刊>Biochemistry >Serine protease of hepatitis C virus expressed in insect cells as the NS3/4A complex
【24h】

Serine protease of hepatitis C virus expressed in insect cells as the NS3/4A complex

机译：丙型肝炎病毒丝氨酸蛋白酶在昆虫细胞中以NS3 / 4A复合物的形式表达

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Hepatitis C virus (HCV) protease NS3 and its protein activator NS4A participate in the processing of the viral polyprotein into its constituent nonstructural proteins. The NS3/4A complex is thus an attractive target for antiviral therapy against HCV. We expressed the full-length NS3 and NS4A in insect cells as a soluble fusion protein with an N-terminal polyhistidine tag and purified the two proteins to homogeneity. Cleavage at the junction between HisNS3 and NS4A occurs during expression, producing a noncovalent complex between HisNS3 and NS4A with a subnanomolar dissociation constant. We purified the HisNS3/4A complex by detergent extraction of cell lysate and by metal chelate chromatography. We removed the His tag by thrombin cleavage and then further purified the complex by gel filtration. The purified NS3/4A complex is active in a protease assay using a synthetic peptide substrate derived from the NS5A-NS5B junction, with k(cat)/K-m of 3700 (+/- 600) M-1 s(-1), an order of magnitude above those previously reported for NS3 expressed by other strategies. This high protease activity implies that the full-length sequences of NS3 and NS4A are required for optimal activity of the NS3 protease domain. We examined the dependence of the NS3/4A protease activity on buffer conditions, temperature, and the presence of detergents. We find that, under most conditions, NS3 protease activity is dependent on the aggregation state of the NS3/4A complex. The monodisperse, soluble form of the NS3/4A complex is associated with the highest protease activity. [References: 32]
机译：丙型肝炎病毒（HCV）蛋白酶NS3及其蛋白激活剂NS4A参与将病毒多蛋白加工成其组成性非结构蛋白。因此，NS3 / 4A复合物是针对HCV的抗病毒治疗的有吸引力的靶标。我们在昆虫细胞中将全长NS3和NS4A表达为具有N端多组氨酸标签的可溶性融合蛋白，并将这两种蛋白纯化至同质。表达期间在HisNS3和NS4A之间的连接处发生裂解，在HisNS3和NS4A之间产生具有亚纳摩尔离解常数的非共价复合物。我们通过去污剂细胞裂解液的去污剂提取和金属螯合层析纯化了HisNS3 / 4A复合物。我们通过凝血酶切割去除了His标签，然后通过凝胶过滤进一步纯化了复合物。使用衍生自NS5A-NS5B连接的合成肽底物，k（cat）/ Km为3700（+/- 600）M-1 s（-1），纯化的NS3 / 4A复合物在蛋白酶测定中具有活性。比其他策略先前报道的NS3数量级高一个数量级。这种高蛋白酶活性暗示NS3和NS4A的全长序列是NS3蛋白酶结构域的最佳活性所必需的。我们检查了NS3 / 4A蛋白酶活性对缓冲液条件，温度和去污剂存在的依赖性。我们发现，在大多数情况下，NS3蛋白酶的活性取决于NS3 / 4A复合物的聚集状态。 NS3 / 4A复合物的单分散，可溶形式与最高的蛋白酶活性有关。 [参考：32]

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