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首页> 外文期刊>Nucleic Acids Research >In vivo, high-resolution analysis of yeast and mammalian RNA-protein interactions, RNA structure, RNA splicing and ribozyme cleavage by use of terminal transferase-dependent PCR.
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In vivo, high-resolution analysis of yeast and mammalian RNA-protein interactions, RNA structure, RNA splicing and ribozyme cleavage by use of terminal transferase-dependent PCR.

机译：在体内，通过使用末端转移酶依赖性PCR对酵母和哺乳动物RNA-蛋白质相互作用，RNA结构，RNA剪接和核酶裂解进行高分辨率分析。

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We have investigated the analysis of RNA by use of terminal transferase-dependent PCR (TDPCR), a procedure previously used for the analysis of DNA and chromatin [J.Komura and A.D.Riggs, Nucleic Acids Res.,26, 1807-1811 (1998)]. When preceded by reverse transcription (RT), TDPCR provides an extremely sensitive, versatile, quantitative and nucleotide-level assay for detecting RNA lesions or structures that block primer extension during the RT step. The procedure is: (i) RT using a gene-specific oligonucleotide; (ii) ribo-tailing of the single-stranded cDNA product by use of terminal deoxy-nucleotidyl transferase; (iii) ligation of a DNA linker to the tailed cDNA by use of T4 DNA ligase; and (iv) PCR using a nested, gene-specific primer and a linker-specific primer. This procedure combines the versatility of a primer extension assay with nucleotide-level resolution, the specificity of nested primers and the sensitivity of PCR. Band patterns obtained are reproducible and quantifiable. We successfully used the technique for the study of yeast RNA structure, splicing intermediates and ribozyme cleavage. Also, in vivo footprint experiments, using mammalian cells and RNase T1, revealed the binding of iron-responsive element binding protein to iron responsive elements in the mRNAs of transferrin receptor and ferritin H-chain.
机译：我们已经研究了通过使用末端转移酶依赖性PCR（TDPCR）来分析RNA的方法，该方法以前用于DNA和染色质的分析[J.Komura和ADRiggs，Nucleic Acids Res。，26，1807-1811（1998 ）]。在进行逆转录（RT）之前，TDPCR提供了一种极其灵敏，通用，定量和核苷酸水平的检测方法，用于检测在RT步骤中阻断引物延伸的RNA损伤或结构。程序是：（i）使用基因特异性寡核苷酸进行RT; （ii）通过使用末端脱氧核苷酸转移酶对单链cDNA产物进行核糖尾化; （iii）通过使用T4 DNA连接酶将DNA接头与尾状cDNA连接; （iv）使用嵌套的基因特异性引物和接头特异性引物进行PCR。该程序将引物延伸测定的多功能性与核苷酸水平的分辨率，嵌套引物的特异性和PCR的灵敏度结合在一起。获得的条带模式是可重现和可量化的。我们成功地将这项技术用于研究酵母RNA结构，剪接中间体和核酶裂解。此外，使用哺乳动物细胞和RNase T1进行的体内足迹实验显示，铁传递因子受体结合蛋白与运铁蛋白受体和铁蛋白H链的mRNA中的铁响应元素结合。

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