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Untersuchungen zu den Mechanismen der Assemblierung und Disassemblierung von Desmosomen am Beispiel des Pemphigus

机译：用天疱疮的例子研究桥粒的装配和拆卸机制

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Desmosomen sind spezialisierte Haftstrukturen, die die Stabilisierung des Zellverbundes gegenüber Zug- und Scherkräften gewährleisten. Dazu binden desmosomale Cadherine extrazellulär an Haftmoleküle benachbarter Zellen und sind intrazellulär unter anderem über Desmoplakin (DP) und Plakoglobin (PG) an Keratinfilamenten verankert. Insbesondere für das desmosomale Cadherin Desmoglein 3 (Dsg3), das sowohl innerhalb als auch außerhalb der Desmosomen vorkommt, wurde eine wichtige Bedeutung als Adhäsionsprotein in Keratinozyten nachgewiesen. Trotz ihrer Funktion, Widerstand gegen hohe mechanische Belastungen zu vermitteln, sind Desmosomen dynamische Strukturen, die einem stetigen Umbau unterliegen. Die Notwendigkeit einer genauen Regulierung des desmosomalen Auf- und Abbaus wird durch das Vorkommen zahlreicher vererbbarer und autoimmuner Erkrankungen unterstrichen. In der vorliegenden Arbeit wurden Mechanismen, die der geordneten Assemblierung der Desmosomen und der Disassemblierung nach Störung der desmosomalen Zell-Zell-Haftung unterliegen, untersucht.udIm ersten Teil der vorliegenden Studien standen die Vorgänge der Desmosomenbildung in humanen Keratinozyten im Fokus. Adhärenskontakte und deren Zusammenwirken mit Actinfilamenten spielen eine wichtige Rolle in der Ausbildung der Desmosomen. Für die Actin-Bindeproteine Adducin und Cortactin wurde durch siRNA-Interferenzstudien eine essentielle Funktion für die Vermittlung der desmosomalen Zell-Zell-Haftung nachgewiesen. Die siRNA-induzierte Depletion von Adducin verursachte eine Reduktion der zytoskelettal-gebundenen Dsg3-Moleküle, was mit einer reduzierten Membranmobiltät korrelierte. Für Cortactin wurde eine direkte Interaktion mit Dsg3 mittels zweier unabhängiger molekularbiologischer Methoden nachgewiesen. Dies deutet auf eine direkte Rolle des Cortactins in der Regulierung der Desmosomen hin. Die siRNA-induzierte Depletion von E-Cadherin führte zum Verlust der membranständigen Lokalisation von Dsg3 und zu einer verminderten Verankerung der Dsg3-Moleküle innerhalb der zytoskelettalen Proteinfraktion. Es wurde ein Signalkomplex aus extradesmosomalen Dsg3, E-Cadherin und der Tyrosinkinase Src identifiziert, dessen Stabilität durch Src reguliert wurde. Hierbei wurden Dsg3 und E-Cadherin an Tyrosinresten durch Src phosphoryliert, deren Aktivität sowohl für die Inkorporation von Dsg3 in die Desmosomen als auch für die Reifung der Desmosomen zu stabilen Haftkontakten essentiell war.udIm zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die Prozesse der desmosomalen Disassemblierung nach Inkubation mit Pemphigus vulgaris-Autoantikörpern (PV-IgG) analysiert.PV ist eine etablierte Modellerkrankung zur Untersuchung der Desmosomen-vermittelten Zelladhäsion in Keratinozyten. Die Bindung der gegen Dsg1 und Dsg3 gerichteten PV-IgGs induziert eine Reduktion der Dsg3-Proteinmengen und eine Aktivierung verschiedener Signalwege, u.a. von RhoA und PKC. Da diese Signalwege ebenfalls Adducin regulieren und PV-IgGs eine Umorganisierung des Actin-Zytoskeletts verursachen, die durch exogene Aktivierung von RhoA verhindert wird, wurde das Zusammenspiel von PV-IgGs, RhoA und Adducin untersucht. Die protektive Wirkung der RhoA-Aktivierung auf die Zell-Zell-Haftung und die Verteilung von Dsg3 nach Applikation der PV-IgGs war sowohl von der Expression als auch von der Phosphorylierung von Adducin an Serin726 abhängig. Interessanterweise verursachten PV-IgGs über den Ca2+-Einstrom und über PKC, unabhangig von RhoA, eine schnelle Phosphorylierung von Adducin an Serin726. Die durch den Ca2+-Einstrom- und PKC-vermittelte Phosphorylierung von Adducin könnte somit einen Rettungsmechanismus der Keratinozyten darstellen, der in Reaktion auf die PV-IgG-Bindung einsetzt und die desmosomale Assemblierung induziert. Ferner wurde die reduzierte Verankerung der Keratinfilamente an Desmosomen, ein weiteres Merkmal der PV-Pathogenese, mit der Aktivität von PKC korreliert. Keratinfilamente, die einer dynamischen Regulierung durch p38MAPK unterliegen, lösen sich in Reaktion auf PV-IgGs von den Desmosomen und akkumulieren perinukleär. Dieses Phänomen der Zytokeratin-Retraktion wurde durch Inkubation mit Tandempeptid (TP), das die Transinteraktion von Desmogleinen stärkt, verhindert.udZusammenfassend liefern die in dieser Arbeit gewonnenen Daten neue Erkenntnisse über die Mechanismen des desmosomalen Umsatzes. Adducin und E-Cadherin nehmen eine essentielle Rolle in der Ausbildung und Aufrechterhaltung der desmosomalen Haftstrukturen ein. Untersuchungen der pathogenen Effekte der PV-IgGs unterstreichen die hohe Relevanz eines intakten Actin- und Keratin-Stützgerüsts für die interzelluläre Haftung von Keratinozyten. Diese Befunde könnten in Zukunft auch von medizinischer Relevanz für die Therapie von Pemphigus-Patienten sein.
机译：桥粒是专门的粘附结构，可确保细胞网络抵抗拉伸和剪切力的稳定性。为此目的，桥粒钙粘着蛋白在细胞外与相邻细胞的粘附分子结合，并在细胞内锚定于角蛋白细丝，尤其是通过去粘蛋白（DP）和白蛋白（PG）。特别是对于在桥粒内部和外部都出现的桥粒钙粘着蛋白桥粒芯蛋白3（Dsg3），已证明在角质形成细胞中作为粘附蛋白具有重要作用。尽管它们具有赋予高机械负载抗性的功能，但桥粒还是动态结构，需要不断进行重建。由于存在许多可遗传和自身免疫性疾病，因此强调了对桥粒形成和分解的精确调控的需求。在本工作机制中，研究了桥粒的有序组装和桥粒细胞-细胞粘附破坏后的拆卸。粘附接触及其与肌动蛋白丝的相互作用在桥粒的形成中起重要作用。对于肌动蛋白结合蛋白adducin和cortactin，通过siRNA干扰研究证明了介导桥粒细胞间粘附的基本功能。 siRNA诱导的adducin耗竭导致细胞骨架结合的Dsg3分子减少，这与膜迁移率降低有关。对于Cortactin，已使用两种独立的分子生物学方法证明了与Dsg3的直接相互作用。这表明皮质激素在调节桥粒中具有直接作用。 siRNA诱导的E-钙黏着蛋白耗竭导致Dsg3的膜定位丢失，并使Dsg3分子在细胞骨架蛋白部分中的锚固减少。鉴定了桥外Dsg3，E-钙粘着蛋白和酪氨酸激酶Src的信号复合物，其稳定性受Src调节。 Dsg3和E-钙黏着蛋白在Scr的酪氨酸残基上被磷酸化，其活性对于将Dsg3掺入桥粒以及使桥粒成熟以形成稳定的胶粘剂接触都是必不可少的与寻常型天疱疮自身抗体（PV-IgG）孵育后。PV是用于研究桥粒介导的角质形成细胞粘附的模型疾病。针对Dsg1和Dsg3的PV IgG的结合可诱导Dsg3蛋白量的减少和不同信号通路的激活。由RhoA和PKC提供。由于这些信号传导途径也调节阿杜生，并且PV-IgG引起肌动蛋白细胞骨架的重组，而RhoA的外源激活阻止了该重组，因此研究了PV-IgG，RhoA和阿杜生之间的相互作用。在应用PV-IgG后，RhoA激活对细胞-细胞粘附和Dsg3分布的保护作用依赖于阿杜生素向丝氨酸726的表达和磷酸化。有趣的是，无论RhoA是什么，PV-IgG都会通过Ca2 +流入和PKC引起Adducin快速磷酸化为丝氨酸726。因此，Ca2 +内流和PKC介导的阿杜生磷酸化可能代表了角质形成细胞拯救机制，该机制可响应PV-IgG结合而启动，并诱导桥粒组装。此外，角蛋白细丝对桥粒的锚固减少（PV发病机理的另一个特征）与PKC的活性有关。受到p38MAPK动态调节的角蛋白长丝在对PV-IgG的反应中从桥粒脱落并在核周聚集。通过与坦肽（TP）孵育可防止这种细胞角蛋白缩回现象，从而增强了桥粒芯蛋白的相互作用，总的来说，这项工作中获得的数据为桥粒更新的机理提供了新见解。 Adducin和E-Cadherin在桥粒粘附结构的形成和维持中起着至关重要的作用。对PV-IgG的致病作用的研究强调了完整的肌动蛋白和角蛋白支持结构与角质形成细胞间粘附的高度相关性。将来，这些发现也可能与天疱疮患者的治疗有关。

著录项

  • 作者

    Rötzer Vera;

  • 作者单位
  • 年度 2016
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