法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-06-30
授权
授权
2019-05-03
实质审查的生效 IPC(主分类):A61K33/36 申请日:20181129
实质审查的生效
2019-04-09
公开
公开
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体地说，本发明涉及肿瘤标志蛋白抑制剂及其在抑制肿瘤标志蛋白中的应用。
背景技术
肿瘤(tumor，neoplasm)是指细胞在致瘤因素作用下失去对其生长的正常调控，导致异常增生而产生的疾病。肿瘤可分为良性和恶性肿瘤两大类。前者生长缓慢，与周围组织界限清楚，不发生转移，对人体健康危害不大。后者生长迅速，可转移到身体其它部位，还会产生有害物质，破坏正常器官结构，使机体功能失调，威胁生命。恶性肿瘤也叫癌症(cancer)是目前危害人类健康最严重的一类疾病。在美国，恶性肿瘤的死亡率仅次于心血管疾病而居第二位。
肿瘤分子标志物(Tumor Marker)是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。
14-3-3是一类磷酸丝/苏氨酸结合蛋白家族，包括α/β、γ、ε、σ、ξ、τ和η七个亚型，通过调控相关转录因子、生物合成酶、细胞骨架蛋白和凋亡因子等，在多种生命过程中发挥重要作用。其中，14-3-3η亚型能够显著增强肝癌细胞增殖、抗凋亡、血管生成和Sorafenib抵抗。然而14-3-3η不是膜蛋白，其在胞外主要以外泌体形式存在，导致无法通过抗体进行靶向干预。目前尚无14-3-3η特异性小分子化学抑制剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肿瘤标志蛋白抑制剂及其在抑制肿瘤标志蛋白活性中的应用。
在本发明的第一方面，提供了一种砷化物的用途，用于抑制14-3-3η蛋白的表达活性，或者用于制备14-3-3η蛋白的抑制剂。
在另一优选例中，所述砷化物选自下组：
砷的氧化物、砷的卤化物、砷的氢化物、和有机砷。
在另一优选例中，所述砷化物选自下组：
三氧化砷(As2O3)、五氧化砷(As2O5)、氟化砷(AsF3、AsF5)、氯化砷(AsCl3、AsCl5)、和溴化砷。
在另一优选例中，所述14-3-3η蛋白源自体外样本。
在另一优选例中，所述用途还包括增加14-3-3η蛋白的泛素化水平。
本发明的第二方面提供了一种体外抑制14-3-3η蛋白表达及活性的方法，所述方法包括步骤：
(1)提供样本，所述样本中含有14-3-3η蛋白；
(2)将样本和砷化物混合，从而抑制所述14-3-3η蛋白的活性。
在另一优选例中，所述样本为细胞培养液、细胞裂解液、血液样本、胸水、脑脊液、腹水。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，将样本和砷化物混合后，所述砷化物的含量为约0.01ng/ml－100ng/ml；优选地，所述砷化物的含量为约0.1ng/ml－10ng/ml。
在另一优选例中，所述砷化物选自下组：
砷的氧化物、砷的卤化物、砷的氢化物、和有机砷。
在另一优选例中，所述砷化物选自下组：
三氧化砷(As2O3)、五氧化砷(As2O5)、氟化砷(AsF3、AsF5)、氯化砷(AsCl3、AsCl5)、和溴化砷。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了IP-HG-AFS实验设计流程。
图2显示了IP-AFS实验结果。
图3显示了ATO对14-3-3η泛素化及表达水平的影响。
具体实施方式
本发明人在研究过程中意外地发现砷化物可显著抑制14-3-3η蛋白的活性，能够作为14-3-3η蛋白的抑制剂从而用于体外抑制14-3-3η蛋白的活性，用于新药研发或用于治疗14-3-3η蛋白相关的肿瘤。在此基础上，完成了本发明。
在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
14-3-3蛋白
14-3-3是一类磷酸丝氨酸/苏氨酸结合蛋白家族，包括α/β、γ、ε、σ、ξ、θ/τ和η七个亚型。
14-3-3η的氨基酸序列如下：
砷化物
砷化物是指一种含有金属砷的化合物。主要包括：
(1)砷的氧化物
元素砷可形成两种砷的氧化物，三氧化砷(As2O3)和五氧化砷(As2O5)。As2O3与水反应生成亚砷酸(H3AsO2)，还能生成3种盐类，正砷酸盐(如Na3AsO3)、偏亚砷酸盐(如NaAsO2)、焦亚砷酸盐(如Na4As2O5)。As2O5与水反应生成3种砷酸，正砷酸(H3AsO4)、偏砷酸(HAsO3)和焦砷酸(H4As2O7)，这些酸又可生成相应的盐。
(2)砷的卤化物
单质砷与卤素作用生成砷的卤化物，如氟化砷(AsF3、AsF5)、氯化砷(AsCl3、AsCl5)、溴化砷(AsBr3)，这些卤化物易挥发。
(3)砷的氢化物
砷与氢结合生成剧毒的砷化氢(AsH3)，已知的还有As2H2、As4H2。砷化氢相当不稳定，加热时分解为单质砷，微热时与硫作用生成单质砷和硫化氢，与受热金属相遇可放出氢气并生成相应的砷化物，砷化氢还是一种很强的还原剂。
(4)有机砷
三价砷和五价砷均能形成C-As键化合物，现已能合成数十种之多，如苯基胂酸[C6H5AsO(OH)2]，有些有机砷还是有名的化学毒气，如路易氏气(Lewisite)，即氯乙烯基二氯胂(ClCH＝CH-AsCl2)，三甲胂[(CH2)3As]是一种很毒的有机砷。
其中，三氧化二砷(ATO)已被证明是一种治疗急性早幼粒性白血病的有效制剂；亦可选择性对多种实体瘤细胞发挥显著抑制作用。在肝癌研究方面，包括本课题组在内多个研究表明：ATO通过表遗传修饰、调控相关转录分子和趋化因子等方式阻滞肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制细胞的促血管生成、侵袭转移和自我更新能力。本发明人原创性地发现ATO能够特异性与14-3-3η，而非14-3-3家族其它6个亚型相结合。本发明结合砷化物常规检测方法，设计了免疫沉淀联合原子吸收光谱分析实验(IP-HG-AFS)，发现：在14-3-3η-IP复合物中能够检测到ATO。进一步应用蛋白酶体抑制剂MG-132预处理细胞后，再用ATO处理发现其能够显著增加14-3-3η蛋白的泛素化水平。综上所述，本研究表明ATO能够作为靶向14-3-3η的抗肿瘤药物，例如5-氟尿嘧啶耐药的人肝癌。
下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
实施例1免疫沉淀联合原子吸收光谱分析实验
图1显示了IP-HG-AFS实验设计流程。具体实验流程如下：
将对5-氟尿嘧啶耐药的人肝癌Bel-7402细胞(Bel/5-Fu)常规培养48h后，加入20μM蛋白酶体抑制剂MG-132预处理2h，再用10μM三氧化二砷(ATO)处理6h。
使用碧云天公司生产的Western及IP细胞裂解液(货号：P0013)提取细胞总蛋白，加入5μl用于免疫沉淀的14-3-3η一抗(购自美国Cell Signaling Technology公司，货号9640S)，4℃摇床孵育过夜，期间不时拨动EP管。再加入40μl充分重悬IgG Agarose(购自碧云天公司，货号P2009)，4℃摇床孵育过夜。2500rpm，4℃离心5分钟，吸取上清于1.5ml EP管(作为阳参以及后续验证14-3-3η泛素化水平时使用)，0.5ml PBS洗涤三次(收集第三次洗脱液作为阴参)。加入100μL灭菌双蒸水，充分重悬，18000rpm离心15分钟，弃上清。将沉淀经100℃煮沸(去除Agarose)后，加入5M盐酸(提取沉淀中的ATO)，再加入5M氢氧化钠调整pH至2.0-7.0。
ATO标准品的制备：准确称取0.0198g ATO，加入1ml氢氧化钠溶液(100g/l)和少量水溶解，转入100ml容量瓶中，加入适量盐酸调整其酸度近中性；取10μl ATO母液，溶解于1000μl灭菌双蒸水；吸取中间液50μl，溶解于1ml灭菌双蒸水，使其终浓度为100ng/ml(应用液)。
氢化物发生原子荧光法：特殊砷化镓高强度空心阴极双道原子荧光光谱仪购自北京吉天仪器有限公司。实验工作参数：载流(3.5％HCL+0.1％抗坏血酸+0.1％硫脲)；还原剂(1％KBH4+0.175％KOH)；载气(氩气)；负高压(260V)；灯电流(50-80mA)；原子化器高度(8mm)；载气流量(500ml/min)；屏蔽器流量(800ml/min)；读取时间(9s)；延迟时间(2s)；读取方式(Peak>
图2显示了HG-AFS检测IP复合物中的ATO，从图2可以看出，14-3-3η-免疫沉淀复合物经AFS测定得到荧光强度值143.17，通过标准曲线计算浓度为：5.83ng/ml(图中a点所示)。阳参(图中b点所示，细胞总蛋白去除14-3-3η-免疫沉淀复合物)通过标准曲线计算浓度为19.92ng/ml(注：已知砷化物能够与PML-RAR等蛋白结合，因此在总蛋白中能够检测到ATO)；阴参几乎检测不到荧光强度。
图3显示了ATO对14-3-3η泛素化及表达水平的影响，从图3可以看出：ATO能够显著增加14-3-3η蛋白的泛素化水平。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 肿瘤标志蛋白抑制剂及其在抑制肿瘤标志蛋白中的应用
<130> 000006
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 246
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Gly Asp Arg Glu Gln Leu Leu Gln Arg Ala Arg Leu Ala Glu Gln
1 5 1015
Ala Glu Arg Tyr Asp Asp Met Ala Ser Ala Met Lys Ala Val Thr Glu
202530
Leu Asn Glu Pro Leu Ser Asn Glu Asp Arg Asn Leu Leu Ser Val Ala
354045
Tyr Lys Asn Val Val Gly Ala Arg Arg Ser Ser Trp Arg Val Ile Ser
505560
Ser Ile Glu Gln Lys Thr Met Ala Asp Gly Asn Glu Lys Lys Leu Glu
65707580
Lys Val Lys Ala Tyr Arg Glu Lys Ile Glu Lys Glu Leu Glu Thr Val
859095
Cys Asn Asp Val Leu Ser Leu Leu Asp Lys Phe Leu Ile Lys Asn Cys
100 105 110
Asn Asp Phe Gln Tyr Glu Ser Lys Val Phe Tyr Leu Lys Met Lys Gly
115 120 125
Asp Tyr Tyr Arg Tyr Leu Ala Glu Val Ala Ser Gly Glu Lys Lys Asn
130 135 140
Ser Val Val Glu Ala Ser Glu Ala Ala Tyr Lys Glu Ala Phe Glu Ile
145 150 155 160
Ser Lys Glu Gln Met Gln Pro Thr His Pro Ile Arg Leu Gly Leu Ala
165 170 175
Leu Asn Phe Ser Val Phe Tyr Tyr Glu Ile Gln Asn Ala Pro Glu Gln
180 185 190
Ala Cys Leu Leu Ala Lys Gln Ala Phe Asp Asp Ala Ile Ala Glu Leu
195 200 205
Asp Thr Leu Asn Glu Asp Ser Tyr Lys Asp Ser Thr Leu Ile Met Gln
210 215 220
Leu Leu Arg Asp Asn Leu Thr Leu Trp Thr Ser Asp Gln Gln Asp Glu
225 230 235 240
Glu Ala Gly Glu Gly Asn
245
机译： 组织蛋白酶E作为肿瘤标志物的应用及组织蛋白酶E和组织蛋白酶D作为靶点在抑制肿瘤血管生成中的应用
机译： ccne2作为分层标志物在Pan CDK抑制剂治疗乳腺肿瘤中的应用
机译： 一种基于对hsp90蛋白水平的检测，hsp90蛋白抑制剂在制备药物组合物中的用途，由此获得的组合物及其应用的设计抗肿瘤个体疗法的方法。
